《Clinical and Translational Discovery》：Tumour hepcidin levels as a biomarker for predicting response to immune checkpoint inhibition in advanced non-small cell lung cancer
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本文前瞻性地探讨了铁调素（Hepcidin， HEP）这一铁稳态关键调节因子在晚期非小细胞肺癌（NSCLC）中的表达水平与抗程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）/程序性死亡配体1（PD-L1）单药治疗疗效的关联。研究揭示，肿瘤铁调素高表达（TPS ≥ 50%）的患者，其治疗持续时间、无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）均呈现延长趋势。体外实验进一步证实铁调素能增强干扰素-γ（IFNγ）诱导的活性氧（ROS）生成及细胞毒性。这提示肿瘤铁调素水平或可作为预测免疫检查点抑制剂疗效的潜在生物标志物，其机制可能与调控细胞对IFNγ的敏感性及铁死亡（Ferroptosis）相关。
1 引言
肺癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。尽管晚期肺癌的化疗效果有限，但免疫肿瘤学（IO）药物，尤其是程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）/程序性死亡配体1（PD-L1）抑制剂，已显著改善了包括非小细胞肺癌（NSCLC）在内的多种癌症的治疗结局。PD-L1肿瘤比例评分（TPS）是预测抗PD-1/PD-L1疗法疗效的关键生物标志物，但寻找能与其联用、更精准预测预后的其他因子仍是研究热点。
铁调素（Hepcidin， HEP）是铁稳态的主要调节因子，在多种癌症（包括NSCLC）中存在过表达。其通过与铁输出泵膜铁转运蛋白（Ferroportin）结合并促使其降解，减少细胞铁外流，增加细胞内铁储存。铁不仅是细胞增殖所必需的，其过量的二价铁离子（Fe2+）还能通过芬顿反应产生活性氧（ROS），诱导铁死亡（Ferroptosis），这是一种铁依赖性的细胞死亡形式。研究表明，由CD8+T细胞促进的肿瘤铁死亡参与了PD-1/PD-L1抑制剂的抗肿瘤活性。然而，铁调素过表达对晚期NSCLC（aNSCLC）患者免疫治疗疗效的影响尚不明确。
因此，本研究旨在评估抗PD-1/PD-L1抗体单药治疗在aNSCLC患者中的疗效与肿瘤铁调素表达水平的关系，并探究其潜在的体外机制。
2 方法
本研究为回顾性观察性研究。纳入2016年1月1日至2018年8月24日期间，在横滨市立大学医学院接受纳武利尤单抗（Nivolumab）、帕博利珠单抗（Pembrolizumab）或阿特珠单抗（Atezolizumab）单药治疗（任意治疗线数）且经组织学确诊的aNSCLC患者。从既往研究队列的108名患者中，筛选出45名拥有足够剩余福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）肿瘤标本的患者进行免疫组织化学（IHC）染色分析。
使用抗铁调素-25抗体（anti-Hepcidin-25 antibody）进行IHC染色。根据铁调素TPS将患者分为两组：高表达组（TPS ≥ 50%， n = 6）和无至中度表达组（TPS 0–49%， n = 39）。主要评估指标包括治疗持续时间、无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）。同时，从癌症基因组图谱肺腺癌（TCGA-LUAD）和肺鳞状细胞癌（TCGA-LUSC）数据库中获取临床和RNA测序数据，分析编码铁调素的HAMP基因的表达谱及其预后意义。
在体外实验中，使用人肺腺癌细胞系A549，探究铁调素与干扰素-γ（IFNγ）共培养对细胞内ROS积累（使用ROS检测试剂盒通过流式细胞术测定）和细胞活力（使用CCK-8试剂盒测定）的影响。统计学分析使用GraphPad Prism 10软件，生存分析采用Kaplan-Meier法和时序检验。
3 结果
3.1 参与者特征
在45名可分析患者中，6名（13.3%）被归类为铁调素高表达，39名（86.7%）为无至中度表达。两组在年龄、性别、组织学类型、PD-1/PD-L1抑制剂治疗线数以及PD-L1 TPS状态方面均无显著差异。仅有两名患者携带表皮生长因子受体（EGFR）驱动基因突变，且均属于无至中度表达组。铁调素高表达组的中位治疗疗程为42次（范围2-82），显著长于无至中度表达组的5次（范围1-121）。
3.2 PD-1/PD-L1抑制剂在铁调素高表达aNSCLC中的疗效
中位随访时间为459天。铁调素高表达组的中位PFS为2222天，无至中度表达组为126天，疾病进展的风险比（HR）为0.35（95% CI， 0.16–0.79； p = 0.0643）。铁调素高表达组的中位OS未达到，无至中度表达组为459天，死亡HR为0.46（95% CI， 0.18–1.16； p = 0.0994）。尽管未达到统计学显著性，但铁调素高表达组表现出更长的PFS和OS趋势。
基于TCGA数据的分析显示，在LUAD和LUSC队列中，按HAMP基因中位表达水平分组后，其高表达与低表达组间的PFS和OS均无显著差异。
此外，根据PD-L1 TPS的分层分析也未显示TPS高组（≥50%）与无至中度组（0-49%）在PFS和OS上存在显著差异。
3.3 铁调素增强IFNγ诱导的细胞内ROS产生和细胞毒性
IHC分析显示，肿瘤组织中IFNγ的TPS与铁调素TPS呈负相关。为探究潜在机制，进行了体外实验。结果显示，与铁调素共培养显著增强了IFNγ诱导的A549细胞内ROS积累。在细胞活力实验中，双因素方差分析（two-way ANOVA）显示铁调素和IFNγ均对细胞活力有显著的主效应，但两者无显著交互作用。事后多重比较（Dunnett‘s检验）表明，100 nM的铁调素与0 nM相比，能显著降低细胞活力。
4 讨论
恶性细胞通常需要大量铁以维持其旺盛增殖。尽管铁调素过表达在多种癌细胞中均有报道，但其在癌症免疫治疗中的预后意义尚不明确。考虑到CD8+T细胞介导的肿瘤铁死亡有助于PD-1/PD-L1抑制剂的抗肿瘤活性，这是一个重要的研究领域。
本研究发现，与铁调素无至中度表达的aNSCLC患者相比，高表达患者在接受抗PD-1/PD-L1单药治疗后，表现出更长的PFS和OS（尽管差异未达统计学显著性）。值得注意的是，作为抗PD-1/PD-L1治疗的既定预测生物标志物，PD-L1 TPS在本研究队列的分层分析中并未显示出显著差异，这可能归因于样本量有限以及部分患者PD-L1 TPS数据缺失。
与既往研究一致，铁调素高表达的肿瘤组织中IFNγ TPS较低。尽管如此，抗PD-1/PD-L1单药治疗在铁调素高表达病例中表现出的较好疗效提示，铁调素可能调节癌细胞对IFNγ的敏感性。体外共培养实验证实，在铁调素存在的情况下，IFNγ处理的癌细胞ROS积累增强，这意味着铁调素高表达的肿瘤可能对铁死亡具有更高的易感性，从而增强了PD-1/PD-L1阻断的抗肿瘤活性。
本研究存在一些局限性：首先，这是单中心、小样本量的回顾性研究，需要更大规模、多中心的研究来验证铁调素对抗PD-1/PD-L1单药治疗的影响。其次，潜在的分子机制尚未完全阐明，例如未直接评估细胞内铁水平以及铁死亡相关分子的表达变化。第三，未深入探讨铁调素表达对肿瘤微环境的影响，包括其对免疫细胞浸润、癌症相关成纤维细胞相互作用以及IFNγ信号对T细胞功能影响等方面的调节作用。
总之，抗PD-1/PD-L1单药治疗与铁调素高表达aNSCLC患者更长的PFS和OS相关。铁调素或可作为一种预测免疫检查点抑制剂疗效的新型生物标志物，其机制可能涉及通过调节细胞内铁稳态和ROS水平，增强肿瘤细胞对免疫效应分子IFNγ的敏感性及铁死亡易感性。未来需要在更大队列、更多癌种中开展研究，并进行深入的机制探索，以优化铁调素过表达肿瘤的免疫治疗策略。
作者贡献
Masaki Yamamoto设计了研究、进行了体外实验并与Yuichiro Suzukawa共同撰写了手稿。临床研究由Sosuke Kubo和Masaki Yamamoto进行，由Shuhei Teranishi、Makoto Kudo和Takeshi Kaneko监督。所有作者均审阅了手稿草稿并进行了关键性修订，并批准了最终版本。
