模型蛋白在两阶段水热液化过程中的氮转化

《The Journal of Supercritical Fluids》：Nitrogen transformation of model protein during two-stage hydrothermal liquefaction

本研究通过两阶段水热液化（150-250℃和250-350℃）探究模型蛋白（BSA）中氮的转化与迁移路径，发现低温阶段氮以氨基酸和蛋白态氮为主，高温阶段生成氮杂环并进入生物油，最终提出氮迁移机制，为提高生物油质量及氮资源回收提供理论依据。

　　

卢清琪|大岛良人|秋月雅人

东京大学前沿科学研究生院环境系统系，日本千叶县柏市柏之叶5-1-5，邮编277-8563

摘要

两阶段水热液化（2-stage HTL）包括一个低温阶段和一个高温阶段，该技术在进行生物油生成和从富含蛋白质的生物质中回收养分方面具有优势。在2-stage HTL过程中，氮（N）的转化既影响生物油的质量，也影响其他营养产品的再利用，其中蛋白质是氮的主要来源。本研究在不同的温度（低温阶段150–250°C，高温阶段250–350°C）和停留时间（10–30分钟）条件下，探讨了模型蛋白质在连续两阶段水热液化过程中的转化和迁移情况。研究了产物中氮的分布、形态和组成，以及氮的迁移路径。在低温阶段（150–250°C），氮主要以蛋白质-N的形式存在于固体中，以氨基酸和胺的形式存在于水相中，在200°C、停留时间30分钟时水相中氮的回收率最高（89.8%）。在高温阶段（250–350°C），氮发生进一步反应，如脱水、内酰胺化和环化，形成生物油中的氮杂环化合物，并改变了水相产物的组成。最终水相中的有机氮组成保持稳定，主要由吡咯谷氨酸和胺组成；然而，氨和硝酸盐的形成强烈依赖于具体条件。基于观察结果，本文提出了详细的氮迁移路径。这项工作为富含蛋白质的生物质在两阶段水热液化过程中的氮演变提供了基础见解。

引言

生物质作为一种潜在的碳中性原料，因其可再生性和可获得性而在能源领域受到关注[1]、[2]。与其他热化学过程相比，水热液化（HTL）是一种在相对温和条件下将生物质转化为生物油的有前景的技术，且无需外部干燥步骤[3]、[4]。生物质的组成对HTL产物有显著影响；其中，蛋白质是生物油生成的重要组成部分[5]。然而，富含蛋白质的生物质（如城市污泥[6]、蛋白质微藻[7]和食物垃圾[8]）在HTL应用中存在挑战。这些原料产生的生物油通常氮含量较高，水相中的化学需氧量、有机氮（org-N）和氨氮（NH??-N）水平也较高。生物油中较高的氮含量会降低其质量，并在燃烧过程中产生氮氧化物排放，而水相部分需要适当处理和处置以减轻环境影响。因此，从环境和经济角度来看，提高生物油的产量和质量，同时实现其他组分（水相、固相等）的回收和适当处置是必要的。

HTL产物中氮的分布和形态尤为重要，因为减少生物油中的氮可以提高其质量，而了解水相中的氮化学性质有助于有效处理和利用。在富含蛋白质的生物质进行HTL过程中，氮的迁移和转化已被广泛研究，结果表明它受到原料性质和操作条件（如温度和停留时间）的显著影响[9]、[10]。在微藻HTL中，通常只有不超过50%的氮被转化为生物油，大部分以NH??-N、org-N或无机氮（NO??-N和NO??-N）的形式转移到水相中。Lu等人研究了不同类型畜禽粪便在HTL过程中的氮转化情况，发现超过37%的氮转移到了水相中，进入生物油的氮不到25%。值得注意的是，在牛肉粪便中，35.7%的氮留在了固相中[10]。在污水污泥中，主要含有蛋白质-N（82.6%），氮首先以org-N的形式释放到水相中，在更严苛的条件下进一步分解为NH??-N。随着温度的升高，固体产物中更稳定的氮物种（如吡咯-N、吡啶-N和季铵-N）的相对含量增加[12]，在青霉素污泥的HTL过程中也观察到了类似的现象[13]。在生物油中，氮的主要来源是氮杂环化合物，这些化合物通过美拉德反应以及氨基酸链断裂、二聚化和环化生成[14]。蛋白质是生物质中氮的主要来源，在决定HTL过程中氮的命运中起决定性作用。温度是控制蛋白质转化的最关键因素之一。在较低温度下，蛋白质会发生水解和分解，包括脱羧和脱氨基，生成水溶性含氮中间体，如氨基酸和胺。相反，在较高温度下，缩合、环化和美拉德反应促进了杂环氮化合物的形成，这些化合物会在生物油中积累[15]、[16]。基于这种温度依赖性，提出了两阶段水热液化（2-stage HTL）策略，以降低生物油中的氮含量，同时回收水溶性低温中间体，或通过避免高温直接HTL过程中的分解和缩合竞争来提高生物油的产量。在此过程中，生物质首先经过低温阶段（150–200°C）处理，然后进行高温阶段（300–375°C）处理[17]。根据第一阶段后的液体组分是否分离，2-stage HTL可以分为分离型和连续型[18]。先前的研究表明，分离型2-stage HTL通过去除低温阶段形成的富氮水解物有效降低了生物油中的氮含量[19]、[20]、[21]。根据Jazrawi等人的报告[19]，使用分离型2-stage HTL时，生物油中的氮去除率可达55%。然而，在高温阶段之前去除富氮水解物可能会因碳利用不足而降低生物油产量[17]。连续型2-stage HTL通常由于保留了低温阶段的液体组分而获得更高的生物油产量。对于Enteromorpha clathrata，气相色谱-质谱（GC-MS）分析表明，2-stage HTL（200°C、停留时间30分钟，随后300°C、停留时间30分钟）产生的生物油中吡嗪和吡咯等氮化合物的相对含量低于直接HTL（300°C、停留时间60分钟）[22]。He等人报告称，Chlorella连续两阶段HTL过程中生物油中的氮含量取决于每个阶段的温度和停留时间。在低温阶段（150–250°C、停留时间10–20分钟）和较高温度（350°C、停留时间10分钟）下，生物油中的氮含量增加，但在不同的高温持续时间（20分钟）下得到了相反的结果[23]。无论采用何种配置，水相中也观察到了大量含氮化合物[16]。

尽管先前的研究已经考察了不同2-stage HTL条件下生物油中氮的变化，并确定了特定原料的通用反应路径，但不同温度下形成的氮中间体及其向生物油、水相和固相的迁移机制仍不完全清楚。特别是，对水相和固相中氮物种的系统表征，以及低温中间体对最终产物分布的影响仍缺乏研究。鉴于蛋白质是HTL产物中氮的主要来源，使用模型蛋白质进行研究有助于阐明复杂生物质混合物在水热过程中的氮转化路径。我们之前的工作详细揭示了2-stage HTL与直接HTL在生物油生成反应路径上的差异[24]；然而，使用模型蛋白质尚未全面研究2-stage HTL过程中氮的命运。理解这一点对于阐明氮组分的内在化学路径至关重要。

在这项研究中，我们使用模型蛋白质探讨并比较了每个阶段温度和停留时间对2-stage HTL过程中氮转化的影响。研究了水相、生物油和固相产物中氮的分布和氮物种的演变，特别关注了低温阶段的中间产物及其对最终产物的影响。本研究填补了一个基础研究空白，并为富含蛋白质的生物质在2-stage HTL过程中的氮转化路径提供了宝贵见解。

材料

材料

选择牛血清白蛋白（BSA）（纯度>98.0%，V级，pH 7.0，用于生物化学实验）作为模型蛋白质。提前准备了2%重量的BSA溶液用于HTL实验。使用二氯甲烷（DCM）收集产物。所有试剂均购自Wako Pure Chemical Industries, Ltd（日本）。蒸馏水使用Aquarius RFD240蒸馏装置（ADVANTEC，日本）制备。

水热液化程序

本研究同时进行了连续型2-stage HTL和1-stage HTL实验。

每个阶段产物中的氮分布

根据相产率结果（图S2），在150–250°C的低温阶段后，产物主要分布在水相和固相中。相反，直接HTL和2-stage HTL的最终产物中的氮几乎完全不存在于固相中，且低于检测限。因此，本研究仅分析了第一阶段的固相和水相中的氮，以及最终产物中的生物油和水相中的氮。

结论

在这项研究中，我们探讨了在不同温度和每个阶段停留时间下2-stage HTL过程中的氮迁移情况。在低温阶段，氮主要以氨基酸的形式存在于水相中，以蛋白质-N的形式存在于固相中。随着过程进入高温阶段，氮通过分解、脱水和内酰胺化反应重新分布到生物油和水相中。这些路径取决于氨基酸的特性。

资金来源

本研究未获得公共部门、商业部门或非营利组织的任何特定资助。

未引用参考文献

[11]

CRediT作者贡献声明

秋月雅人：撰写 – 审稿与编辑，监督，项目管理。大岛良人：撰写 – 审稿与编辑，项目管理。卢清琪：撰写 – 初稿撰写，数据可视化，方法学研究，数据整理，概念构建。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的财务利益或个人关系。

致谢

作者衷心感谢东京大学多个实验室提供的慷慨支持和设施便利。GC-MS分析在柏分校的Tonokura实验室进行。元素分析在本乡校区的Microanalytical实验室进行。XPS测量在工程创新研究所的Nano-Engineering Research Center进行。NO??分析在柏分校的Kawano实验室进行，NH??分析