《LabMed Discovery》：Toward standardized antithrombin activity assays: multicenter evaluation and optimization
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本研究针对临床检测中低水平抗凝血酶（AT）活性测量存在的显著变异与挑战，通过一项多中心研究，评估并优化了不同分析系统的AT活性检测方法。研究通过建立低水平校准曲线、规范试剂复溶流程及增强质量控制等措施，显著提高了Systems A和B在低活性水平（10%和15%）的检测性能，为AT活性检测的标准化及临床安全应用（如指导Fitusiran用药）提供了可行方案。
抗凝血酶（AT）是我们体内一种至关重要的天然抗凝蛋白，堪称血液凝固系统的“核心刹车器”。它的主要工作就是精准抑制凝血级联反应中的关键蛋白酶，比如凝血酶和活化凝血因子Ⅹ（FⅩa），从而防止血栓过度形成。临床上，肝素等常用抗凝药必须与AT“搭档”才能发挥千倍的抗凝效力，一旦AT活性低于70%，肝素效果就会大打折扣，低于30%时则几乎无效。因此，无论是诊断遗传性或获得性抗凝血酶缺乏症，还是监测像Fitusiran这类通过RNA干扰机制特异性降低AT活性的新型血友病治疗药物，准确测量AT活性都至关重要，特别是当AT水平处于15%到35%这样的“治疗窗口”时，任何测量误差都可能直接影响到用药剂量和患者安全。
然而，现实中的AT活性测量却面临着不小的挑战。目前临床上主要使用发色底物法进行测定，但不同的检测系统（比如使用牛凝血酶或牛FⅩa作为试剂）之间存在差异，尤其是在AT活性水平较低时，测量的不精确性和实验室间结果的不可比性变得尤为突出。外部质量评估显示，在没有标准化的情况下，实验室间的变异系数（CV）可能高达15%-25%或更高。这种不一致性给临床决策带来了困扰，也阻碍了像Fitusiran这类精准治疗药物的安全应用。针对这些问题，来自中国多个顶尖医疗中心的研究人员开展了一项名为“Toward standardized antithrombin activity assays: multicenter evaluation and optimization”的研究，旨在系统评估并优化AT活性检测方法，尤其聚焦于低水平检测的准确性和可重复性，该研究成果已发表在《LabMed Discovery》期刊上。
为了开展这项研究，研究人员主要运用了以下几项关键技术方法：首先，制备并验证了冻干质控品，其AT活性水平分别为正常值的10%、15%、35%和100%。其次，设计并执行了一个包含初始评估、方法优化和再评估三阶段的多中心研究流程，共涉及国内九家临床实验室，涵盖了三种不同的分析系统（System A, B, C）。核心的优化措施包括建立专门针对低活性范围（0%-30%）的校准曲线，调整样品预稀释比例，以及实施更严格的试剂复溶和质控管理。最后，利用统计学方法（如回收率、变异系数、配对t检验、Deming回归等）对实验数据进行系统分析，以评估优化前后的性能变化。
研究结果
3.1. 质控品的验证
研究首先验证了所用的冻干质控品。结果显示，在各活性水平上，质控品的平均测量值均接近预期值，回收率在目标值的±20%以内。在10%和15%低水平下，组内CV分别低于10%，在35%和100%水平下则低于5%。均匀性检验的F值均低于临界值，表明质控品批内均匀性良好。稳定性检验也证实，质控品在复溶后8小时内保持稳定，为后续的多中心评估提供了可靠的基础。
3.2. 初始评估研究结果
在最初的九家实验室评估中，研究人员观察到了显著的实验室间差异，尤其是在低活性水平。具体而言，使用System C的实验室在10%和15%活性水平上表现出明显的偏差和较差的可重复性，难以获得稳定可靠的结果。相比之下，使用System A和System B的实验室结果更接近目标值，且重现性更好。基于这些发现，研究团队决定在后续的优化研究中纳入使用System A和B的实验室，而将System C排除在外。
3.3. 低水平抗凝血酶活性检测的优化
研究针对System A和B实施了优化方案。核心措施之一是建立低水平校准曲线。以其中一家实验室为例，使用System A建立的校准曲线R2值达到0.9998，System B的R2值也达到了0.9914，表明在低活性范围内，AT活性与光密度（OD/min）之间存在极佳的线性关系。此外，优化还包括标准化试剂复溶步骤、使用自动化移液，以及增加日常低水平质控等。
3.4. 再评估研究结果
优化措施的效果在再评估研究中得到了验证。除了初始参与的五家实验室，还新增了四家使用System A和B的实验室。结果显示，在10%和15%活性水平，优化后测量的偏差明显减小，实验室间CV显著改善，回收率也得到提升。在15%水平，几乎所有参与实验室的回收率和精密度都达到了预设的接受标准。在35%水平，无论是使用常规校准曲线还是低水平校准曲线，回收率都已处于可接受的±20%范围内，表明两种校准策略结合可以覆盖较宽的检测范围。然而，在10%水平，尽管CV得到了控制，回收率仍有部分实验室未能完全达标，但整体性能相比优化前仍有提升。
3.5. 质控品的互换性
研究还对质控品与患者样本的互换性进行了评估。在使用AT缺乏血浆稀释国际标准品时，System C表现出较差的回收率，因此被排除在后续互换性分析之外。Deming回归分析显示，System A和B之间，以及它们各自与System C之间，所用的质控品结果均落在基于临床样本建立的95%预测区间内，证明这些质控品具有互换性，可以替代患者样本用于方法评估和实验室间比对。优化后，质控品在System A和B之间仍保持良好的互换性。
结论与讨论
本研究通过系统性的多中心评估，揭示了不同AT活性检测系统，特别是System C，在低水平检测中存在的显著偏差和不可比性问题。通过对表现较好的System A和B实施一系列针对性优化（包括建立低水平校准曲线、标准化操作和强化质控），成功将低水平（尤其是15%和35%）AT活性测量的准确性和精密度提升到了临床可接受的水平，并显著改善了实验室间结果的一致性。这一优化策略不仅为临床实验室提供了一个可操作的标准化工作流程，提升了AT缺乏症诊断和血栓风险评估的可靠性，也为Fitusiran等靶向AT的新型疗法的安全监测提供了更可靠的实验室依据。尽管System C的优化未能成功，且在10%活性水平的性能仍有提升空间，但考虑到15%-35%是更关键的临床决策区间，本研究的成果具有明确的实践价值。最终，该研究建立的工作流程和优化措施，可作为未来制定抗凝血酶活性检测专业指南或专家共识的重要基础，推动该领域检测结果的标准化与互认。
