《iMetaOmics》：Comprehensive assessment of unfolded protein response and its association with tumor progression in pan-cancer
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本文综述了当前对内质网未折叠蛋白反应（UPR）在癌症中作用的认识，并指出系统性评估其泛癌图谱与肿瘤特征关联的不足。作者为此开发了一个基于转录组的UPR基因特征（signature），并利用基因集变异分析（GSVA）为每个肿瘤/细胞分配UPR评分，以此描绘了33种肿瘤和28种正常组织的UPR全景图，揭示了其显著的肿瘤间与肿瘤内异质性。研究进一步整合了转录组及单细胞转录组数据，揭示了UPR激活与多种关键基因组及免疫特征之间的稳健关联。最后，通过机器学习算法，作者从UPR角度识别并验证了一个具有潜力的乳腺癌（BRCA）预后生物标志物。本工作为评估人类癌症中的UPR活性提供了有效方法，并强调了UPR在癌症进展中的临床意义。
引言
内质网（ER）在维持蛋白质稳态（proteostasis）、钙代谢以及脂质和葡萄糖合成中起着核心作用。各种内外刺激会破坏内质网的蛋白质折叠能力，导致错误折叠和未折叠蛋白质积累，从而引发内质网应激并激活未折叠蛋白反应（UPR）。在生理条件下，UPR的瞬时激活是一种保护机制，通过上调分子伴侣、减少分泌蛋白负荷以及增强内质网相关降解（ERAD）和自噬来恢复稳态。然而，在慢性或未解决的内质网应激下，UPR信号通路（如PERK-ATF4和IRE1-XBP1途径）的持续激活会从细胞保护作用转变为促肿瘤作用，促进存活、代谢重编程和炎症，共同推动恶性转化和肿瘤进展。因此，系统性地评估UPR与肿瘤进展的关联并探索其临床意义至关重要，但大多数先前用于评估UPR活性的基因特征均来源于特定肿瘤类型的批量RNA测序（RNA-seq）数据，其普适性有限。本研究旨在填补这一空白。
结果
1. 鉴定用于评估癌症UPR状态的基因特征
为了克服现有UPR基因特征的局限性，本研究整合了来自16项不同研究的130个RNA-seq样本的高通量转录组学数据集。在消除批次效应后，通过加权基因共表达网络分析（WGCNA）构建了共表达网络。其中，蓝色模块与UPR激活的相关性最高。根据基因显著性（GS）> 0.4和模块成员资格（MM）> 0.7的标准，最终筛选出159个与UPR激活强相关的基因，构成了UPR基因特征。该特征在多个独立数据集（包括小鼠模型数据）中得到了验证，显示出较高的敏感性和稳健性，能够跨细胞系、组织和物种可靠地量化UPR状态。
2. 描绘泛癌中的UPR全景图
利用所识别的UPR特征，通过单样本基因集富集分析（ssGSEA）对基于GTEx数据库的28种正常组织（超过9000个样本）和基于TCGA数据库的33种肿瘤（约10000个样本）的UPR状态进行了评估。结果揭示了UPR活性的组织特异性模式：生殖系统组织（如子宫、宫颈、卵巢）及其对应肿瘤（如前列腺腺癌、卵巢癌、子宫体子宫内膜癌）表现出较高的UPR评分；而心血管系统、皮肤和腺体来源的组织（如胰腺、血管、心脏、甲状腺）及其对应肿瘤（如皮肤黑色素瘤、急性髓系白血病、甲状腺癌）的UPR评分相对较低。进一步比较14种TCGA癌症类型中肿瘤与匹配的癌旁组织，发现10种肿瘤类型的UPR评分存在显著差异，其中9种癌症的UPR活性升高，而甲状腺癌略有下降。这些结果证实，UPR激活是人类癌症（尤其是实体瘤）中常见的分子特征。
3. UPR水平与肿瘤特征之间的癌症类型特异性关联
研究揭示了UPR激活与关键肿瘤特征之间的多维关联。在10种具有不同UPR水平的肿瘤类型中，UPR评分与MYC调控网络呈正相关，而与ATF2和PTEN调控的基因等肿瘤抑制特征呈负相关。将样本根据中位UPR评分分为高UPR组和低UPR组后，基因集富集分析（GSEA）显示，高UPR组的差异表达基因（DEGs）在大多数肿瘤中显著富集于促炎反应、上皮-间质转化（EMT）通路的正调控以及DNA修复通路的负调控。这些发现将UPR激活与肿瘤免疫和转移联系起来。
在肿瘤免疫方面，UPR状态与免疫检查点分子表达相关。除肺腺癌（LUAD）外，高UPR肿瘤中CD274（PD-L1）的表达均升高。同时，UPR评分与肿瘤微环境（TME）中M2巨噬细胞的浸润呈正相关，尤其是在乳腺癌（BRCA）中，表明UPR激活与免疫抑制有关。此外，高UPR肿瘤的干细胞性（stemness）评分也持续高于低UPR肿瘤，表明UPR激活与癌症干细胞性存在联系。
4. 单细胞分析揭示肿瘤内UPR异质性
为了探究UPR在肿瘤微环境细胞类型间的异质性，研究分析了来自26名BRCA患者的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据。结果显示，浆细胞和肿瘤细胞的UPR评分较高，而T细胞和B细胞的UPR评分较低。同时，在成纤维细胞中观察到UPR活性的强异质性，进一步区分发现，成纤维细胞比肌成纤维细胞表现出更高的UPR活性。对其他五种肿瘤（肝细胞癌、非小细胞肺癌、胰腺腺癌、前列腺腺癌、默克尔细胞癌）的scRNA-seq数据分析也得出一致结论：肿瘤细胞表现出最高的UPR活性，而基质细胞和免疫细胞的UPR活性相对较低。
5. UPR激活与单细胞水平转录组特征的关联
根据UPR活性将肿瘤细胞分为高、低两组，差异表达分析显示，高UPR肿瘤细胞中与细胞周期和增殖、代谢重编程以及炎症反应相关的通路显著富集，这与批量转录组结果基本一致。将BRCA样本根据匹配的批量RNA-seq数据分为高UPR组和低UPR组后，优势比（OR）分析显示，浆母细胞和髓系细胞在高UPR组中表现出强烈的分布偏好，同时高UPR组患者中髓系细胞、浆细胞和周期细胞的浸润增加。这些发现表明，恶性细胞的UPR活性可能影响BRCA肿瘤微环境中免疫细胞（特别是髓系细胞）的浸润。
6. 肿瘤微环境中髓系细胞亚群的特征
鉴于高UPR组中髓系细胞浸润显著增加，研究对髓系细胞进行了重新聚类，分为10个亚群。结果显示，Macro3和Macro4与其他亚群相比表现出最高的UPR活性水平，并且在高UPR组中Macro3和Macro4细胞的丰度增加。对这两个亚群的标志基因进行富集分析发现，Macro3上调的差异表达基因主要与干扰素反应相关，高表达ISG15、CXCL9、CXCL10和CD274等基因，具有干扰素启动的肿瘤相关巨噬细胞（IFN-TAM）特征；而Macro4上调的基因则主要与脂质代谢相关，高表达APOC1、APOE等基因，表现出脂质相关TAM（LA-TAM）的特征。细胞间通讯分析进一步揭示，在高UPR活性的肿瘤中，肿瘤细胞通过MIF信号通路频繁与Macro3和Macro4细胞进行通讯，这表明UPR激活的肿瘤细胞可能通过MIF信号增强Macro3和Macro4细胞的浸润。
7. 根据UPR评分预测免疫治疗反应
研究评估了UPR评分预测免疫治疗反应的潜力。在对抗PD1/抗CTLA4治疗敏感的BRCA小鼠模型中，治疗后肿瘤细胞的UPR评分下降；而在免疫治疗耐药的默克尔细胞癌（MCC）患者中，治疗后肿瘤细胞的UPR评分显著升高。此外，在五个BRCA队列中，UPR评分与免疫抑制分子（如PDCD1、BATF）和细胞因子（如IL4、IL13）呈正相关，而与免疫刺激分子（如GZMK、CST7）呈负相关。这些发现表明，较高的UPR激活与抗肿瘤免疫受损相关，且UPR评分升高的肿瘤往往对免疫治疗耐药。
8. 利用UPR状态预测BRCA预后
为了探索UPR特征的转化价值，研究采用三种机器学习算法（LASSO、XGBoost和随机森林结合Boruta）来识别预后相关的枢纽基因。通过多因素Cox回归模型，构建了一个基于三个常见基因（SHMT2、KDELR2和SLC1A4）的UPR预测因子。在训练集（TCGA-BRCA）和四个独立验证集中，高UPR预测因子评分与患者更差的总体生存期和更晚的病理分期显著相关。该预测因子在验证集中的曲线下面积（AUC）为0.62–0.76，其预后预测性能优于先前发表的代表性模型。此外，UPR评分还与肿瘤增殖、血管生成和细胞外基质重塑相关基因（如TEK、ITGA9）的表达呈正相关。这些数据证明了UPR特征在预测患者预后方面的效力。
讨论与结论
本研究开发了一个跨泛癌的特异性UPR基因特征，为比较不同肿瘤类型的UPR活性提供了统一标准。基于此，研究描绘了UPR在人类癌症中的全景图，揭示了其在不同肿瘤类型和细胞背景下的显著异质性，以及与关键基因组和免疫特征之间的强关联。研究发现，UPR激活与上皮-间质转化（EMT）和肿瘤干细胞性显著相关，并与肿瘤免疫抑制有关，特别是促进了具有免疫抑制功能的巨噬细胞亚群（如IFN-TAM和LA-TAM）的浸润。重要的是，UPR相关基因显示出对免疫治疗反应和患者预后的重要临床意义。以BRCA为例，通过机器学习鉴定的UPR相关预后生物标志物在多个数据集中表现出稳健的预测能力。
当然，本研究也存在一些局限性，例如UPR特征仅纳入了激活相关基因，未能详细评估UPR各分支通路，单细胞测序的测序深度可能影响UPR评分的准确性，以及生物信息学分析主要提供了相关性而非因果关系的证据。未来的研究需要结合实验验证来进一步探索UPR激活影响肿瘤特征的潜在分子机制。
总而言之，本研究为评估人类癌症中的UPR活性提供了一种可行的方法，并强调了UPR激活在癌症进展中的临床相关性，加深了我们对UPR在癌症中作用的理解，为其机制研究和治疗探索提供了有价值的参考。
