《Molecular Oral Microbiology》：Environmental Stress Induces Altered Composition of Streptococcus mutans Membrane Vesicles: pH-Driven Changes in Membrane Vesicle Production and Composition
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这篇综述深入探讨了pH变化等环境应激如何影响变形链球菌膜囊泡（MVs）的生物发生与货物组成。研究揭示酸性条件(pH5.2)导致MVs产量增加、体积减小，并显著改变其RNA与蛋白质内容物。这些成分变化不仅是细菌适应性策略的体现，更重塑了MVs介导的口腔微生态菌-宿主相互作用，为理解其在炎症和口腔疾病（如龋病）中的作用提供了分子基础。
1 引言：膜囊泡（MVs）作为细菌的通讯工具与应激响应器
细菌膜囊泡（Membrane Vesicles, MVs）是由原核与真核细胞通过细胞膜出芽释放的纳米级囊泡结构。它们在细菌的免疫逃避、营养获取、生物膜形成和疾病进展中扮演关键角色。无论是革兰氏阳性菌还是革兰氏阴性菌，其产生的MVs都携带着来源细胞的蛋白质、核酸（DNA/RNA）、毒素等多种分子，从而介导细胞间通讯和环境适应。环境因素，如pH、温度、营养匮乏等，会进一步调控MVs的产量和组成，深刻影响其在疾病进展中的作用。特别是在动态变化的口腔微环境中，以变形链球菌（Streptococcus mutans）为代表的主要致龋菌，频繁面临糖代谢导致的pH剧烈波动（如降至5.5以下）。该菌通过强大的酸耐受反应（Acid Tolerance Response, ATR）在酸性环境中存活并引发龋病。此前研究已证实酸性条件能增加S. mutans的MV释放并改变其蛋白质和代谢物谱，但其RNA货物（尤其是小RNA）如何响应pH变化尚属未知。本研究旨在系统探究pH应激如何影响S. mutansMVs的产量、形态学特征及分子货物组成，以阐明其在细菌适应和宿主互作中的潜在意义。
2 研究方法：模拟口腔酸性应激与多维度表征
本研究使用变形链球菌标准菌株UA159，分别在中性（pH7.2）和酸性（pH5.2）的脑心浸液（BHI）肉汤中进行培养，以模拟口腔健康与致龋（酸性）环境。通过生长曲线分析确认了酸性应激导致的早期生长延缓。采用差异离心结合0.22μm过滤和超速离心的方法从培养上清中分离纯化MVs，部分样品进一步通过碘克沙醇（OptiPrep）密度梯度离心进行精制。运用负染色透射电子显微镜（TEM）和纳米颗粒追踪分析（NTA）对MVs的形态、大小和浓度进行可视化与定量。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和银染分析蛋白质组成与差异。采用高灵敏度试剂盒分别从MVs和全细胞中提取小RNA，并通过RNA测序（RNA-seq）技术，对比分析不同pH条件下MVs与全细胞的小RNA转录组谱。差异表达基因和通路富集分析则借助CLC Genomics Workbench和Biocyc数据库平台完成。
3.1 MVs的形态与生化特性在酸性条件下发生显著改变
电镜观察证实了MVs的囊泡结构。NTA分析显示，与中性条件相比，酸性条件（pH5.2）下产生的MVs平均尺寸更小（99.86 ± 5.697 nm vs. 103.6 ± 5.545 nm），但浓度显著增加（115.4 ± 26.49 vs. 76.08 ± 20.65），表明酸性应激促进了MV的生物发生或改变了其稳定性。生化分析进一步揭示，酸性条件不仅使MV中的总蛋白浓度显著升高，还改变了特定蛋白质（约160、67和61 kDa）的包装模式。同时，酸性MVs中的总RNA浓度也更高。有趣的是，尽管MVs产量增加、体积变小，但每个单个MV颗粒的RNA含量在两种条件下无显著差异，提示酸性应激主要影响MV的生成数量和整体货物装载量，而非单个囊泡的RNA包装密度。
S. mutans bacterial membrane vesicles grown at a pH of 7.2 (A) and 5.2 (B) were visualized using negative staining transmission electron microscopy (TEM), revealing their size, shape, and structural integrity. For nanoparticle tracking analysis (NTA), Zetaview was used to assess and compare the size distribution and concentration of isolated particles in both conditions. (C) Average size of MVs using NTA (N = 26). (D) Average concentration of MVs using NTA (N = 26). (E) Protein concentrations measured in vesicles from each growth condition (n = 10). (F) RNA concentrations measured in vesicles grown at each pH level, highlighting any differences in packaging between the two conditions (n = 12). (G) The amount of RNA in each individual membrane vesicle particle (n = 12). *p < 0.05; p < 0.01;**p < 0.0001.">
3.2 MV的RNA组成随pH发生选择性变化
RNA-seq分析揭示了MV RNA组成的pH依赖性变化。在中性MVs中，丰度高于500 TPM的转录本以转运RNA（tRNA，~79%）为主，其次是核糖体RNA（rRNA，~12%）。而在酸性MVs中，蛋白质编码RNA的比例大幅上升至16%，tRNA比例降至~70%。相比之下，全细胞的小RNA组成变化趋势不同：中性条件下蛋白质编码RNA占31%，酸性条件下则降至13%，tRNA比例相应升高。火山图分析进一步显示，酸性条件下MV中的tRNA、rRNA和非编码RNA（ncRNA）主要表现为负向倍数变化（下调），而全细胞中这些RNA类别则多为正向变化（上调）。这种截然相反的趋势强烈表明，RNA被包装进入MVs的过程并非随机溢出，而是一个受pH调控的、具有选择性的主动过程。
S. mutans whole cells as a function of environmental conditions. Transcriptomic analysis of S. mutansMVs. (A) RNA packaging patterns in MVs grown at pH 7.2, including average TPM values (above 500 TPM), the most abundant transcripts, and their proportional distribution in a pie chart. (B) RNA packaging patterns in MVs grown at pH 5.2, including average TPM values (above 500 TPM), the most abundant transcripts, and their proportional distribution in a pie chart. (C) RNA packaging patterns in small RNA within the whole cells grown at pH 7.2, including average TPM values (above 500 TPM), the most abundant transcripts, and their proportional distribution in a pie chart. (D) RNA packaging patterns in small RNA within the whole cells grown at pH 5.2, including average TPM values (above 500 TPM), the most abundant transcripts, and their proportional distribution in a pie chart. (E) Volcano plot from MVs, displaying transcripts that are differentially expressed between pH 7.2 and pH 5.2, illustrating upregulated and downregulated transcripts. (F) Volcano plot from small RNA within the whole cells, displaying transcripts that are differentially expressed between pH 7.2 and pH 5.2, illustrating upregulated and downregulated transcripts.">
3.3 tRNA与rRNA的包装呈现pH依赖性与选择性
深入分析发现，虽然MV中的总tRNA水平在两种pH间无差异，但特定氨基酸对应的tRNA种类丰度发生了显著变化。例如，tRNA-Arg在酸性条件的MV和全细胞中均更丰富，而tRNA-Ser则在中性条件下更富集。更值得注意的是，tRNA-Glu、tRNA-Gly、tRNA-Asp等在MV和全细胞中呈现相反的丰度变化趋势，这进一步印证了MV RNA货物的选择性包装。在rRNA方面，酸性MV中16S rRNA的丰度显著高于中性条件，而5S rRNA则在中性MV中更丰富。在全细胞中，酸性条件下23S rRNA显著富集。这些差异表明，不同rRNA亚基进入MVs的机制也受到环境pH的精密调控，可能反映了在应激状态下核糖体相关组分分选的改变。
S. mutans membrane vesicles (MVs) and whole cells grown at pH 7.2 and pH 5.2, highlighting differential RNA packaging between the two conditions. (A) The average TPM of tRNA in both growth conditions from the MVs. (B) The average TPM of tRNA in both growth conditions from small RNA within the whole cells. (C) Different types of tRNAs identified within the MVs, with significant differences indicated by *p < 0.05, p < 0.01, orp < 0.0001. (D) Different types of tRNAs identified within the small RNA in the whole cells, with significant differences indicated by *p < 0.05,p < 0.01, or p < 0.0001. (E) Most common types of rRNA detected in MVs, with significant differences indicated byp < 0.001 orp < 0.0001. (F) Most common types of rRNA detected in small RNA within the whole cells, with significant differences indicated byp < 0.001 or ****p < 0.0001. n = 3.">
3.4 全细胞转录组揭示酸性应激下的代谢重塑
对S. mutans全细胞在酸性条件下的转录组进行通路富集分析，揭示了其应对应激的全局策略。显著富集的通路包括：L-组氨酸生物合成（与应激信号传导相关）、ATP生物合成与前体代谢物和能量生成（满足高能量需求）、脂肪酸与脂质生物合成（为MV膜合成提供原料）。这些上调通路为观察到的MV产量增加和成分变化提供了代谢背景。相反，显著耗竭的通路包括：tRNA装载和氨酰-tRNA充电（可能与减缓翻译以适应生长减缓有关）、大分子修饰（节省能量以优先用于应激适应）。这些代谢重编程清晰地描绘了细菌在酸性压力下，将资源向生存、能量生产和膜/囊泡生物合成倾斜，同时下调非必需进程的画面。
Streptococcus mutans RNA-seq under acidic conditions. Differentially expressed genes identified by whole-cell RNA-seq were analyzed using the BioCyc database to identify pathways significantly enriched or depleted under acidic conditions. (A) Pathways that are enriched (Green). (B) Pathways that are depleted (Purple).">
4 讨论：选择性包装的MVs——细菌适应与致病的新视角
本研究系统阐明了pH应激如何重塑S. mutansMVs的物理特性和分子货物。酸性条件驱使细菌产生更多、更小的MVs，并选择性改变其RNA和蛋白质货物。RNA货物的变化尤其显著，表现出与全细胞转录组不同的、甚至相反的趋势，这强有力地支持了MVs的RNA包装是一个受调控的、选择性的过程，而非简单的细胞内容物随机包裹。
这种pH依赖性的选择性包装具有重要的生物学意义。富含特定tRNA（如tRNA-Arg）的MVs可能被运送到微环境中的其他细菌或宿主细胞，通过影响蛋白质合成或作为信号分子来调节群体行为或宿主免疫反应（例如激活Toll样受体TLRs）。5S rRNA在MV中的选择性富集可能暗示其在应激条件下参与核糖体稳定或作为独立的信号分子。同时，全细胞代谢向组氨酸合成、能量生产和脂质合成的倾斜，为MV的增产和膜组建提供了直接的原料和动力支持。
从口腔健康的角度看，这项研究将S. mutans的MV生产与口腔Stephan曲线（餐后pH骤降）关联起来。在pH降至5.2以下的致龋窗口期，S. mutans通过调整MV策略，可能增强了其在生物膜内的通讯、竞争能力，或通过递送特定货物（如毒力因子或免疫调节分子）来加剧牙釉质脱矿和局部炎症，从而促进龋病进展。MVs作为细菌间及菌-宿主间通讯的关键载体，其成分的应激依赖性变化，为理解口腔微生态失衡如何导致疾病提供了新的分子视角。此外，鉴于MVs在多种全身性疾病（如呼吸道炎症、脓毒症、动脉粥样硬化甚至阿尔茨海默病）中的牵连，针对MV生物发生或货物分选机制的干预，可能成为未来抗感染或抗炎治疗的新策略。
S. mutans MVs. The Circos graph provides a comprehensive visualization of the Streptococcus mutansgenome and associated RNA sequencing data. (a) The outermost blue ring represents the entire S. mutansgenome. (b) The subsequent five tracks depict RNA-sequencing data, color-coded as follows: purple for rRNA, blue for tRNA, pink for protein-coding regions, orange for ncRNA, and gold for miscellaneous RNA (miscRNA). (c) The innermost four tracks illustrate RNA packaged in membrane vesicles, with red representing MVs grown at pH 5.2 and gray representing MVs grown at pH 7.2. The scatter plots within these tracks display transcript abundance as transcripts per million (TPM), providing a comparative view of RNA packaging at different pH conditions.">
综上所述，这项研究不仅深化了对细菌MVs作为动态、可调节的“分子包裹”的认识，也揭示了环境应激通过重塑MV介导的通讯网络来影响微生物适应性与致病性的精细机制。它将口腔局部环境变化、细菌应激生理与潜在的全身健康影响联系起来，为基于微生态调控的疾病防治开辟了新的思路。
