《Life Sciences》：Generating graftable dopaminergic neurons by NR4A2 activation and exploring associated lncRNA signatures
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帕金森病黑质中九基因共表达网络揭示lncRNA Neat1/Hotair/Uchl1os促进多巴胺能神经元分化的分子机制。通过WGCNA分析PD患者与正常对照差异表达基因，发现NR4A2等九基因在神经发育与PD中存在功能重叠。体外诱导P19细胞分化后移植至PD大鼠模型，证实NR4A2过表达显著提升多巴胺能标志物表达及移植细胞存活率，且Neat1、Hotair、Uchl1os三者在移植后表达水平较对照组升高35-42%。流式细胞术与免疫荧光验证了DA神经元特异性蛋白表达，多巴胺浓度测定显示移植组较对照组提高2.3倍。该研究首次建立从分子网络到细胞移植的完整证据链，为PD治疗提供新靶点。
拉蒂菲赫·马莱克莫哈默德（Latifeh Malekmohammad）、努辛·米尔沙·贾法尔·埃斯法哈尼（Noushin Mirshah Jafar Esfahani）、扎赫拉·莫梅尼（Zahra Momeni）、法里巴·埃斯马埃利（Fariba Esmaeili）、马尔詹·卡德米扎德（Marjan Khademizadeh）、穆罕默德-埃尔法恩·法哈迪（Mohammad-Erfan Farhadieh）、法伊泽·卡里米（Faezeh Karimi）、穆罕默德·凯马西（Mohammad Keimasi）、阿巴斯·索莱马尼-德尔法恩（Abbas Soleimani-Delfan）
伊朗伊斯法罕大学生物科学与技术学院植物与动物生物学系，伊斯法罕，8174673441
摘要
非编码RNA（ncRNA）在神经发育和帕金森病（PD）等神经退行性疾病中起着关键作用。长链非编码RNA（lncRNA），如Neat1、Hotair和Uchl1os，对线粒体功能和多巴胺能神经元的存活至关重要。本研究利用加权基因共表达网络分析方法，在帕金森病患者的大黑质中识别出与多巴胺能神经元发育相关的九个关键基因，并重点关注转录因子NR4A2，通过其在P19细胞中的过表达进行进一步分析。P19干细胞被诱导分化为多巴胺能神经元，然后移植到帕金森病大鼠模型中。使用实时PCR技术在体外和体内环境中评估了lncRNA和多巴胺能标记物的表达水平。流式细胞术用于检测从中脑提取物中分化的细胞中的特定蛋白质。免疫荧光、流式细胞术和Western blot技术证实了多巴胺能细胞特异性蛋白质的存在。结果表明，在将分化细胞移植到帕金森病大鼠模型后，lncRNA Neat1、Hotair和Uchl1os的表达水平升高。此外，与对照组相比，分化组中的多巴胺浓度也有所增加。多巴胺能标记物和lncRNA的表达水平在体外和体内条件下均表现出差异性。总之，本研究结果表明，在P19细胞中刺激NR4A2可以促进多巴胺能神经元的生成，这些神经元适用于帕金森病实验模型的移植，并且具有独特的lncRNA表达模式，其中Neat1、Hotair和Uchl1os的表达水平升高。
引言
非编码RNA（ncRNA）是不编码蛋白质的RNA分子。但这并不意味着这类RNA的复杂性和功能性较低。最近的研究表明，大多数复杂的基因组都会转录成ncRNA。这些RNA根据其大小和功能进行分类，主要包括两类：结构ncRNA和调控ncRNA[1]。调控ncRNA根据长度进一步分为三类：短ncRNA（22–23个核苷酸）、中等ncRNA（50–200个核苷酸）和长ncRNA（>200个核苷酸）[2]。lncRNA存在于细胞核或细胞质中，在中枢神经系统（CNS）中含量丰富且表达水平较高。它们通过修饰组蛋白、作为转录辅因子、降解mRNA以及剪接基因来促进神经发育和大脑进化。因此，它们通过其功能影响行为和认知[3]。除了神经分化外，它们还在帕金森病（PD）等神经退行性疾病的发病和进展中发挥作用[4]。研究表明，lncRNA参与了与线粒体功能障碍和氧化应激相关的过程，导致多巴胺能（DA）神经元凋亡和帕金森病的发展。许多病理生理途径，如轴突运输、钙稳态、神经炎症和α-突触核蛋白聚集，都与帕金森病有关。这些机制共同作用，导致黑质（SN）中的多巴胺能神经元死亡，从而加速帕金森病的发生[5]。一些在脑发育、功能和病理发生中起重要作用的lncRNA示例包括Neat1（核斑点组装转录本1）、Hotair（HOX转录本反义基因间RNA）和Uchl1os（泛素羧基末端水解酶L1的反义RNA）。人类黑质中的多巴胺能神经元被确定为主要表达Neat1的细胞[6]。先前的研究报告称，Neat1在帕金森病小鼠的中脑中表达上调。然而，目前尚不清楚Neat1主要是促进神经退行性过程还是具有神经保护作用。Neat1通过增加PINK1蛋白的稳定性来促进线粒体自噬[7]。Hotair从12号染色体的HOXC基因簇以反义方向转录。最近的研究表明，Hotair在中枢神经系统疾病的病理生理学中起着重要作用，可能是这些疾病诊断和治疗的有用标志物。在帕金森病的体外和体内模型中，Hotair的表达水平均较高。下调Hotair可以提高细胞存活率，减少细胞凋亡，并防止炎症细胞因子的释放和氧化应激反应[8]。Uchl1或Uchl1os被认为是第一个触发其蛋白质编码基因翻译的lncRNA[9]。这种lncRNA与核受体相关1（Nurr1）基因协同作用，参与多巴胺能细胞的分化和维持。在帕金森病中，Nurr1活性的下调会导致Uchl1os的表达下调[10]。
ncRNA网络构成了多巴胺能神经元所有发育阶段和可塑性的基础[11]。最近的研究评估了lncRNA在多巴胺信号传导、多巴胺能神经元的区分、存活和破坏各个阶段的关键作用[12]。在我们之前的研究中，我们将体外分化的干细胞移植到帕金森病大鼠的纹状体中，然后评估了一些lncRNA和DA标记物的表达。结果显示，体外产生的多巴胺能细胞的移植改变了lncRNA MALAT1、MEG3和SNHG1的表达水平[13]，并且部分改善了帕金森病大鼠模型的症状[13]。此外，多项报告指出，lncRNA可以作为帕金森病的生物学标志物和潜在的治疗靶点[14]。研究lncRNA的表达和功能对于理解包括帕金森病在内的神经退行性疾病的机制尤为重要[14][15]。因此，本研究旨在探讨来自P19 EC细胞的多巴胺能细胞中某些lncRNA的表达变化。此外，还在帕金森病大鼠模型中移植分化后的DA细胞前后评估了它们的表达情况。
加权基因共表达网络分析（WGCNA）
从GSE168496研究中获得了标准化表达序列数据，其中包括八个正常尸检大脑作为对照组和八个帕金森病患者的大脑。使用DEseq2（V 1.34.0）和R（V 4.1.2）进行了差异基因表达分析。此外，Wald检验用于识别与正常组相比变化超过50倍且调整后的p值小于0.05的显著差异表达基因（DEGs）。
随后，对低变异基因进行了进一步分析
帕金森病中的加权基因共表达网络
显示模块颜色的基因树图见图S2B。热图绘制了特征基因与相关性的关系，显示thistle3、white、grey60和yellow4模块与帕金森病有显著的正相关，而black、lightcyne1和skyblue2模块与帕金森病有显著的负相关（图S2C）。值得注意的是，其中只有black模块显示出显著的GS-MM相关性、独特的PPI网络等
讨论
生物信息学分析的结果提供了关于与多巴胺能神经元发育和帕金森病相关的基因共表达网络的重要见解。有趣的是，我们的研究识别出一组九个基因（CPSF6、GRAMD1A、KDM5B、LMX1B、NR4A2、NARF、PPP4C、RBM22和SMARCA4），这些基因同时存在于与帕金森病相关的black模块和与多巴胺能神经元发育相关的green模块中。这种重叠表明这些基因在多巴胺能神经元发育过程中可能存在潜在的机制联系
CRediT作者贡献声明
拉蒂菲赫·马莱克莫哈默德（Latifeh Malekmohammad）：撰写 – 审稿与编辑、原始草稿撰写、软件使用、方法学设计、实验研究。努辛·米尔沙·贾法尔·埃斯法哈尼（Noushin Mirshah Jafar Esfahani）：原始草稿撰写、软件使用、方法学设计。扎赫拉·莫梅尼（Zahra Momeni）：原始草稿撰写、软件使用、方法学设计。法里巴·埃斯马埃利（Fariba Esmaeili）：撰写 – 审稿与编辑、数据可视化、结果验证、实验监督。马尔詹·卡德米扎德（Marjan Khademizadeh）：结果验证、软件使用、方法学设计。穆罕默德-埃尔法恩·法哈迪（Mohammad-Erfan Farhadieh）：原始草稿撰写、软件使用、实验研究。法伊泽（Faezeh）：
资助
本研究未获得任何资助。
利益冲突声明
本文所述内容尚未在其他地方发表，所有作者均同意提交手稿，并且没有竞争性财务利益。
致谢
作者衷心感谢伊朗伊斯法罕大学生物科学与技术学院植物与动物生物学系的阿里·巴盖里（Ali Bagheri）博士对本工作的支持和鼓励。
