《LWT》：Unveiling the mechanisms of different alkali-treated wheat glutenins in modulating retrogradation behavior of wheat amylopectin comparative
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本研究探讨了不同碱性条件下高、低分子量小麦谷蛋白对支链淀粉回生的抑制作用，发现pH 10处理能显著提升谷蛋白网络的二硫键与β-折叠含量，形成更致密的结构，有效限制淀粉链重排，从而延缓老化、提高抗性淀粉含量，为开发高品质、慢消化淀粉基食品提供了新策略。
想象一下，刚出炉的面包松软可口，但放上几天就会变得又干又硬，口感全无。这背后的科学原理就是“淀粉回生”（Starch retrogradation），一种在储存过程中淀粉分子重新排列、结晶的自然现象。它不仅影响了我们日常主食如面包、米饭、面条等产品的口感和品质，缩短了货架期，也与健康息息相关，因为快速消化的淀粉会迅速升高血糖。因此，如何有效抑制淀粉回生，是食品科学与营养健康领域一个重要的挑战。
目前，人们尝试了酶法、物理方法和添加外源物质等多种策略，但它们往往面临成本高、工艺复杂或影响产品品质等问题。在众多成分中，谷物自身含有的蛋白质，特别是小麦中的谷蛋白（glutenin），因其作为内在结构成分，在抑制淀粉回生方面展现出独特潜力。然而，谷蛋白如何与淀粉相互作用，其分子量大小（高/低分子量）以及外部环境（如pH值）如何影响这种相互作用并最终调控回生过程，其深层机制尚不清晰。为了回答这些问题，来自合肥工业大学的研究团队在《LWT》期刊上发表了一项研究，系统比较了不同碱性处理下，高、低分子量小麦谷蛋白调控小麦支链淀粉回生行为的机制差异。
为探究碱性处理下不同分子量谷蛋白与支链淀粉的相互作用及抑制回生的效果，研究者们采用了一系列关键技术方法。首先，从小麦淀粉和谷朊粉中分别分离纯化出支链淀粉（AP）、高分子量谷蛋白（HMW）和低分子量谷蛋白（LMW）。随后，在pH 7至11的不同碱性条件下制备了AP-HMW和AP-LMW复合物，并模拟储存（4°C，7天）以诱导回生。研究运用了多种分析技术：通过测定二硫键（S-S）含量和傅里叶变换红外光谱分析蛋白质网络结构与二级构象变化；利用分子动力学模拟（MD）在原子水平上探究不同pH下蛋白质与淀粉的结合模式与稳定性；通过X射线衍射（XRD）和差示扫描量热法（DSC）评估复合物的结晶度与回生热焓；借助扫描电子显微镜观察储存前后复合物的微观形貌；最后通过体外消化实验测定快消化淀粉、慢消化淀粉和抗性淀粉含量，评估其消化特性。
研究结果揭示了碱性处理，特别是pH 10处理，对谷蛋白结构与功能的优化作用，及其对淀粉回生的有效抑制。
3.1. 二硫键（S-S）
研究发现，在储存过程中，所有样品的二硫键（S-S）含量总体下降，这可能是由于淀粉回生形成的晶体会物理阻碍谷蛋白网络的动态重组。随着pH从7升高到10，谷蛋白的分子交联程度显著增加。在储存7天后，AP-HMW10和AP-LMW10复合物的S-S含量（分别为130.33和100.23 μmol/g）显著高于pH 7处理的对照样。这表明适度的碱性环境促进了巯基氧化和SH/SS交换反应，形成了更多的分子间交联。然而，当pH达到11时，S-S含量急剧下降，说明强碱条件可能引起蛋白质严重变性，抑制了网络结构的形成。在所有条件下，AP-HMW组（高分子量谷蛋白复合物）的S-S含量始终高于AP-LMW组，这归因于HMW亚基含有更多的半胱氨酸残基，有利于形成分子间二硫键。这一结果为理解碱性环境如何调控谷蛋白网络交联提供了直接证据。
3.2. 二级结构组成
傅里叶变换红外光谱分析显示，随着储存时间延长，除AP-HMW11外，所有样品的α-螺旋和β-折叠含量均有所下降，并向无规卷曲转变，表明谷蛋白柔性增加。随着pH升高，AP-HMW和AP-LMW复合物的α-螺旋和β-折叠含量呈上升趋势，而无规卷曲含量减少，表明结构趋于有序。与pH 7处理相比，AP-HMW10和AP-LMW10复合物的β-折叠含量分别从19.09%和18.57%增加至25.47%和22.94%。β-折叠是最稳定、连接最紧密的蛋白质结构之一，其含量的增加表明在pH 10条件下形成了更致密的蛋白质网络。然而，pH 11处理导致β-折叠含量明显下降，这与二硫键含量的降低趋势一致，表明过强的碱处理破坏了维持高级结构的共价交联。值得注意的是，在相同pH条件下，HMW复合物中的α-螺旋和β-折叠含量始终高于LMW复合物，表明AP-HMW组具有更稳定的分子构象，这与其更大的分子尺寸和更丰富的半胱氨酸残基有关。
3.3. pH依赖的分子动力学（MD）模拟
分子动力学模拟从分子尺度揭示了pH对AP-HMW和AP-LMW结合特性的影响。自由能景观和Cα距离差异图的分析表明，在pH 10条件下，蛋白质更倾向于形成低回转半径（Rg）的紧凑构象；而在pH 7条件下，则更倾向于形成扩展构象。分子间相互作用分析显示，在pH 10条件下，氢键和范德华接触的数量均显著高于pH 7条件，表明分子间的结合模式更加紧密，相互作用增强。这直接导致了AP-HMW和AP-LMW复合物的绝对结合能大幅增加（AP-HMW从62增至89 kcal/mol，AP-LMW从35增至66 kcal/mol），证实了在pH 10条件下，蛋白质与支链淀粉的结合更加稳定。模拟结果与实验数据相互印证，阐明了碱性环境促进结构紧凑化和稳定结合的微观机制。
3.4. X射线衍射分析
X射线衍射图谱显示，所有样品在储存过程中，在17°和20°附近的衍射峰强度均增加，这是淀粉回生的典型特征。所有样品的相对结晶度（RC）随着储存时间的延长而增加，表明支链淀粉链发生了渐进性的重排和结晶。然而，经过碱性处理的样品，特别是AP-HMW10和AP-LMW10，其RC值显著低于未经碱性处理的对照组。这表明碱性处理诱导形成的更高交联密度和更致密的谷蛋白网络结构，有效限制了支链淀粉链的重排，从而抑制了有序结晶的形成。在所有处理组中，pH 10处理的样品显示出最低的相对结晶度，表明在此条件下谷蛋白对支链淀粉回生的抑制作用最强。
3.5. 回生特性
差示扫描量热法测定的回生焓（ΔHR）进一步证实了碱性处理对淀粉回生的抑制效果。储存7天后，所有样品的回生焓均有所增加，但pH处理样品的增幅被显著抑制。其中，AP-HMW10和AP-LMW10样品的回生焓增量最小（分别从0.837 J/g增至1.117 J/g，以及从0.986 J/g增至1.233 J/g），表现出最强的抑制效果。这可能是由于在pH 10条件下，HMW和LMW的疏水性增强，促进了更稳定的AP-谷蛋白复合物的形成，这些复合物能与支链淀粉竞争水分，减少塑化作用，从而阻碍淀粉链重结晶所必需的链重排。此外，AP-HMW组的ΔHR值始终低于AP-LMW组，表明高分子量亚基在延缓回生方面具有更强的能力，这可能与其更多的疏水域和更强的结合能力有关。
3.6. 形态特征
扫描电镜图像显示，所有AP-HMW和AP-LMW复合物在储存初期均呈现连续的网络状骨架结构。储存7天后，该结构被破坏，形态变得无序，孔洞分布不均。这是淀粉回生和淀粉-谷蛋白网络破坏的结果。pH处理显著影响了复合物的微观结构：随着pH升高，孔洞数量减少，网络密度增加，形成了更封闭的结构。尤其是在pH 10条件下，结构变得非常致密，几乎无孔洞，表明结构完整性增强。这归因于分子间二硫键的形成和更高比例的β-折叠，促进了更广泛的谷蛋白网络发展。然而，pH 11处理导致网络致密性下降，孔隙率增加，表明淀粉与谷蛋白的相容性降低。比较AP-HMW和AP-LMW组发现，HMW样品通常形成更致密、更连续的网络，孔洞更少，这与其更强的分子间交联和结合能力相符。
3.7. 体外消化率
体外消化曲线显示，所有样品的消化过程呈现典型的双相模式。随着储存时间延长，样品的消化率降低，抗性淀粉含量增加。碱性处理，特别是pH 10处理，显著抑制了支链淀粉的消化。AP-HMW10和AP-LMW10的抗性淀粉含量分别从31.08%和23.93%大幅提高到54.71%和45.27%。这表明适当的碱性处理促进了谷蛋白与支链淀粉的结合，形成了一道物理屏障，限制了酶的可及性。值得注意的是，HMW对支链淀粉消化率的抑制效果强于LMW，AP-HMW10样品获得了最低的消化率（34.91%）和最高的抗性淀粉含量（54.71%），凸显了HMW亚基的优越性。这为通过碱性处理谷蛋白网络来设计具有降低血糖反应的淀粉基食品提供了新视角。
综上所述，本研究阐明了pH 10是调控谷蛋白有效延缓小麦支链淀粉回生的最优化条件。在此条件下，高分子量（HMW）和低分子量（LMW）谷蛋白均形成了最多的二硫键和β-折叠，强化了谷蛋白网络结构。分子动力学模拟证实，在pH 10下，HMW和LMW与支链淀粉的氢键和范德华接触显著增加，结合模式更紧密、更稳定。支链淀粉被嵌入这一网络中，形成致密无缝的复合结构，在回生过程中增强了谷蛋白与支链淀粉的交联，从而阻碍了支链淀粉链的重排及其与水分子的相互作用。与其它pH处理的样品相比，AP-HMW10和AP-LMW10表现出更低的结晶度和回生焓，对支链淀粉回生的抑制效果最强。抗性淀粉含量的增加也导致了AP-HMW10和AP-LMW10消化率的降低。尽管长时间的储存不可避免地会导致蛋白质网络的逐渐瓦解和回生参数的后续上升，但在pH 10处理的样品中，这种劣变速度显著更慢。
这项研究的意义在于，它不仅从分子层面揭示了不同碱性条件下高、低分子量谷蛋白调控淀粉回生的差异机制，更重要的是，为食品工业提供了一种通过温和碱处理（pH 10）来优化谷蛋白网络结构，从而天然、有效地抑制淀粉基食品老化、并同步提升其慢消化特性的新策略。这为开发具有更长货架期、更佳质构和有益血糖管理功能的谷物主食产品奠定了理论基础。未来研究可以将这一策略应用于实际食品体系，并关注其对最终产品感官品质的综合影响，以实现理论与实践的完美结合。
