《LWT》：Mechanistic insights into microbial succession driving flavor formation in traditional Sichuan sausage: A multi-omics approach
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本研究针对传统四川香肠在自然发酵条件下风味形成机制不明确、缺乏理性复合发酵剂设计依据的难题，通过整合16S rRNA/ITS测序、GC × GC-MS及非靶向代谢组学技术，系统解析了发酵过程中细菌和真菌群落的演替规律，揭示了关键微生物（如乳酸菌、酵母菌）及其代谢途径对特征风味物质（如酯类、烯烃类）和有益代谢物（如谷胱甘肽、L-赖氨酸）形成的驱动作用，为开发专属多菌种发酵剂以提升产品一致性提供了理论和实验基础。
在广受欢迎的中华美食版图中，四川香肠以其独特的风味占据一席之地。它的魅力不仅源于高品质的原料和传统工艺，更与发酵过程中那些看不见的“小生命”——微生物——的复杂活动息息相关。不同于依赖可控发酵剂的欧洲干香肠或口味偏甜淡的广式腊肠，传统四川香肠的制作依赖于自然条件下的自发发酵，并使用了大量如花椒、辣椒等特色香料。这些独特的加工参数构成了特殊的选择压力，可能塑造出有别于其他香肠类型的微生物生态系统。尽管风味独特，但目前对于四川香肠发酵过程中，究竟有哪些微生物在起作用，它们如何更迭，又如何协同塑造出那令人回味的复合香气，系统的认知仍存在大片空白。这严重阻碍了为这一特色产品开发专用、高效的复合发酵剂，从而影响了产品的标准化生产和品质稳定性提升。
为了揭开传统四川香肠风味形成的微生物“黑箱”，一项发表于《LWT - Food Science and Technology》的研究采用多组学整合分析策略，深入探究了其发酵过程中的微生物群落演替与风味化合物形成的调控机制。研究结果表明，发酵过程显著重塑了微生物群落结构，以Latilactobacillus（乳杆菌属的一种）、Lactococcus（乳球菌属）为代表的乳酸菌(Lactic Acid Bacteria, LAB)和以Yarrowia（耶氏酵母属）、Apiotrichum（毛孢子菌属）为代表的酵母菌(Yeast)逐渐成为优势菌群。这些微生物的活跃代谢，驱动了挥发性风味物质多样性和总量的显著增加，尤其是提升了β-月桂烯(β-myrcene)、α-蒎烯(α-pinene)、苯乙醇(phenylethyl alcohol)等具有宜人香气化合物的水平。同时，代谢组学分析发现，包括谷胱甘肽(glutathione)、L-赖氨酸(L-lysine)、γ-亚麻酸(gamma-linolenic acid)在内的多种有益代谢物含量随发酵时间增加而上升。研究揭示了微生物代谢预测通路与实测代谢组学富集通路的一致性，明确了特定乳酸菌和酵母菌在形成理想风味中的核心作用，为未来分离关键功能菌株、理性设计复合发酵剂奠定了坚实基础。
研究人员开展这项研究，主要运用了以下几项关键技术方法：首先，在可控温湿度条件下制备了传统四川香肠样品，未添加商业发酵剂。其次，利用16S rRNA和ITS高通量测序技术，动态分析了发酵过程中细菌和真菌群落的多样性及演替。第三，采用全二维气相色谱-质谱联用技术(GC × GC-MS)对挥发性风味化合物进行了深度分析，并依据相对气味活度值(ROAV)鉴定了关键香气成分。第四，运用非靶向代谢组学技术，全面解析了样品的整体代谢物谱，并分析了相关的代谢通路。所有分析均在发酵的第0、3、6、9、12和15天进行采样，实验设置三次重复。
微生物群落在传统四川香肠发酵过程中的特征与动态变化
通过α多样性指数、韦恩图和非度量多维标度分析(NMDS)发现，细菌和真菌群落的演替动态存在差异。发酵过程中，共有116个细菌操作分类单元(OTU)和11个真菌OTU是所有发酵阶段的共有核心类群。随着发酵进行，细菌中Latilactobacillus的相对丰度从最初的2.71%大幅上升至最终的58.01%，成为绝对优势菌属；同时Lactococcus、Lactiplantibacillus（植物乳杆菌属）和Weissella（魏斯氏菌属）也显著增加。在真菌群落中，酵母菌Yarrowia的丰度从8.40%增长至20.26%，Kurtzmaniella（库氏酵母属）也从3.09%增至13.24%。相反，一些早期丰度较高的细菌属（如Acinetobacter不动杆菌属、Brochothrix热死环丝菌属）和真菌属（如Fusicolla）则随发酵进程显著下降。对微生物代谢通路的预测分析显示，细菌和真菌在核苷酸生物合成、氨基酸生物合成、碳水化合物降解、糖酵解及三羧酸(TCA)循环等通路上较为活跃，并且优势微生物在发酵后期对这些通路的贡献度显著增强。
传统四川香肠发酵过程中挥发性风味化合物的动态变化
研究共检测到124种挥发性风味化合物，包括酯类、醇类、烃类、酸类等。发酵显著提升了绝大多数风味化合物的含量。酯类物质（赋予果香、花香）的总量从发酵初期的2664.48 μg/kg最高增长至第12天的7033.92 μg/kg。醇类物质（赋予醇厚、植物香气）和烃类物质（部分源于香料释放，如α-蒎烯、β-月桂烯）的含量也随发酵时间显著增加。通过对相对气味活度值(ROAV)的分析，确定了芳樟醇(linalool)为最主要的香气贡献者，同时β-月桂烯、α-蒎烯、苯乙醇等化合物的ROAV值在发酵后期也呈现增长趋势，表明它们对整体香气的贡献日益突出。
代谢物分析
通过比较发酵初期（第0天）与末期（第15天）的代谢物谱，共鉴定出182个差异表达代谢物，其中93个上调，89个下调。这些差异代谢物主要为氨基酸衍生物、脂肪酸衍生物以及黄酮类等。显著上调的代谢物包括具有抗氧化功能的谷胱甘肽(glutathione)、甜味氨基酸L-赖氨酸(L-lysine)、γ-亚麻酸(gamma-linolenic acid)、异槲皮苷(isoquercitrin)和D-阿拉伯糖醇(D-arabitol)等。代谢通路富集分析显示，氨基酸代谢、脂质代谢以及黄酮与黄酮醇的生物合成等通路在发酵过程中被显著激活。这些通路的活跃与微生物的蛋白质水解、脂肪分解及氧化等代谢活动直接相关，为非挥发性的前体物质转化为挥发性风味化合物提供了生化基础。
主成分分析(PCA)
主成分分析(PCA)结果直观展示了不同发酵时间样品的微生物与代谢物谱的分离。发酵中后期（6-15天）的样品与优势微生物（如Levilactobacillus、Latilactobacillus、Yarrowia）以及多种关键风味化合物和有益代谢物在PCA图中聚集在相近区域。这种空间上的关联性提示，优势细菌和真菌之间可能存在协同代谢关系，共同驱动了风味和有益物质的形成。
结论与讨论
本研究系统阐明了传统四川香肠发酵过程中微生物群落演替驱动风味及代谢物形成的机制。核心结论是，以Latilactobacillus为代表的乳酸菌和以Yarrowia为代表的酵母菌在发酵后期成为优势菌群，它们的代谢活动是挥发性风味物质（特别是酯类、宜人烯烃和醇类）多样性和含量增加，以及谷胱甘肽、L-赖氨酸等有益代谢物累积的关键驱动力。研究通过多组学数据整合，证实了微生物功能预测与实测代谢通路的高度一致性，验证了实验结果的可靠性。这些发现不仅深化了对传统发酵肉制品风味形成原理的理解，更重要的是，它精准指出了对风味形成有积极贡献的关键微生物类群，为后续从这些类群中分离、鉴定具有特定功能（如产酯、产香、抗氧化）的菌株提供了明确靶标。这为开发科学、高效的复合发酵剂提供了坚实的理论和实验依据，对于实现传统四川香肠的标准化、工业化生产，提升产品品质一致性和附加值具有重要的指导意义。未来的研究应聚焦于从这些关键属中分离特定菌株，深入阐明其在代谢物形成和感官品质塑造中的具体角色与协同机制。
