《Chemical Biology & Drug Design》：Coumarin-Augmented Thiazole Hybrids as Dual Anticancer and Antibacterial Agents
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本文综述了香豆素-噻唑杂化体作为靶向细菌DNA促旋酶（DNA gyrase）、拓扑异构酶IV（Topoisomerase IV）和人源拓扑异构酶IIα（Topo IIα）的双效抑制剂的药物化学研究，系统报道了17个新化合物的合成、体外抗癌（HeLa细胞）与广谱抗菌（ESKAPE病原体等）活性评价，并重点通过分子对接、MM/GBSA结合自由能计算及分子动力学模拟阐明了其结合模式与选择性机制，为开发治疗癌症患者合并感染的新策略提供了重要先导化合物。
引言
细菌感染是癌症患者持续的致死原因，其中以肠球菌（Enterococcus faecium）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和肠杆菌属（Enterobacterspp.）为代表的ESKAPE病原体在肿瘤病房的院内感染中尤为臭名昭著。开发兼具抗癌和抗菌活性的先导化合物，是应对这种致命共病的一种潜在策略。香豆素骨架因其多药理活性倾向而闻名，其化疗活性谱涵盖包括抗癌和抗菌在内的多个药理学领域。例如，3,3′-(3,4-二氯苄叉)-双-(4-羟基香豆素)（DCH）的衍生物已分别因其对耐多药金黄色葡萄球菌和狂犬病毒（Lyssavirus rabies）的活性而获得专利。香豆素的抗菌作用机制主要是通过抑制细菌DNA促旋酶和拓扑异构酶IV（Topoisomerase IV）实现的，这两种酶对于DNA复制和转录过程中的负超螺旋化至关重要。细菌DNA促旋酶是由两个亚基GyrA和GyrB组成的二聚体构成的四聚体蛋白。原核拓扑异构酶IV在结构上与促旋酶同源，其亚基ParC和ParE分别对应于GyrA和GyrB。香豆素竞争性地结合GyrB和ParE的ATP酶结构域，从而分别剥夺了DNA促旋酶和拓扑异构酶IV为细菌DNA引入负超螺旋所需的能量。相应地，香豆素通过干扰真核拓扑异构酶IIα（Topo IIα）的活性而发挥抗癌作用，从而抑制癌细胞的快速增殖。
化学合成
研究以香豆素增强的噻唑查尔酮3作为关键支架，通过[3+3]和[3+2]环加成等反应，高效合成了一系列五元和六元杂环衍生物。具体而言，查尔酮3与硫脲4或N-甲基硫脲6反应，通过[3+3]环加成得到嘧啶-2-硫酮衍生物5和7。其红外光谱显示硫羰基（C=S）和NH键的特征吸收峰，核磁共振氢谱中嘧啶硫酮部分的H-5和H-6质子以双峰形式出现，NH基团的信号证实了C=S基团作为主要互变异构体的存在。
此外，查尔酮3与氨基硫脲8和硫代碳酰肼10在回流冰醋酸中缩合，通过[3+2]环加成分别形成相应的吡唑啉衍生物9和11。化合物9的红外光谱显示出硫羰基和NH2基团的吸收峰，其核磁共振氢谱显示了吡唑啉CH2和CH-5的特征信号。
进一步地，查尔酮3与6-氨基硫尿嘧啶12在沸腾醋酸中发生环加成，通过迈克尔加成、环化、脱水及芳构化，生成了相应的吡啶并嘧啶硫酮衍生物13。其红外光谱显示了多个NH、C=O和C=S的吸收峰，核磁共振氢谱显示了吡啶-H和两个NH基团的单峰信号。
为了利用新引入的硫酮基团实现杂环化，吡啶并嘧啶硫酮衍生物13和嘧啶硫酮衍生物5在三乙胺碱性条件下，分别与一系列腙酰氯衍生物14a-g反应，顺利合成了新的吡啶并三唑并嘧啶系列17a-g和三唑并嘧啶衍生物18a-e。反应机理推测为碱催化下的S-烷基化，随后发生Smiles重排，中间体16环化并立即消除H2S分子，得到目标三唑并嘧啶衍生物。所有新化合物的结构均通过红外光谱、核磁共振氢谱、碳谱、质谱及元素分析进行了全面表征。
生物学评价
体外细胞毒活性（HeLa细胞）
采用MTT比色法评估了新合成的噻唑-腙-香豆素衍生物对HeLa宫颈癌细胞的细胞毒性。所有测试化合物均表现出浓度依赖性的细胞活力抑制，IC50值范围在26.8至285.2 μg/mL之间。其中，化合物13显示出最强的活性，IC50为26.8 ± 0.97 μg/mL，其次是化合物18b (37.0 ± 2.13 μg/mL)、11 (47.5 ± 2.13 μg/mL)和17e (54.4 ± 3.06 μg/mL)。相比之下，化合物5和9显示出相对较弱的细胞毒性，IC50值超过90 μg/mL。参比药物多柔比星在相同条件下的IC50为10.59 ± 1.03 μg/mL。虽然所有测试的香豆素均未超过多柔比星的效力，但化合物如13和18b的有利选择性指数（见下文）表明其作为先导抗癌支架的治疗潜力。
抗菌活性（金黄色葡萄球菌）
采用肉汤微量稀释法结合XTT还原试验，评估了合成化合物对三种临床相关的金黄色葡萄球菌菌株的抗菌活性：甲氧西林敏感株（MSSA）、耐甲氧西林株（MRSA）和耐万古霉素株（VRSA）。化合物11、13、17c、17e和18b对所有三种菌株均表现出强效且广谱的抗葡萄球菌活性。值得注意的是，化合物13整体活性最强，对MSSA、MRSA和VRSA的最低抑菌浓度（MIC）分别为0.12 μg/mL、0.48 μg/mL和3.9 μg/mL，在MSSA和MRSA检测中优于万古霉素。化合物11也显示出几乎相当的效力。其他一些化合物如5、7和17b对MRSA和MSSA显示出中等活性，但对VRSA通常无效。
抗菌活性（革兰氏阴性病原体）
采用琼脂孔洞扩散法评估了化合物对五种临床相关革兰氏阴性菌株的活性：肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、鼠伤寒沙门菌和大肠杆菌。在10 μg/mL固定浓度下，测量抑菌圈直径。多个化合物显示出广谱的革兰氏阴性菌活性，最显著的是化合物13，对铜绿假单胞菌（25 mm）、鲍曼不动杆菌（14 mm）、肺炎克雷伯菌（13 mm）和大肠杆菌（33 mm）均有抑制。化合物11和18c也显示出对多数菌株的强抑制作用。
对正常细胞的细胞毒性（WI-38细胞）
为评估化合物的选择性和潜在安全性，使用MTT法测定了它们对WI-38正常人肺成纤维细胞的细胞毒性。大多数化合物对非癌细胞显示出最小的细胞毒性作用，IC50值超过250 μg/mL。化合物18c的整体细胞毒性最低。值得注意的是，对HeLa细胞活性最强的化合物13，在WI-38细胞中也表现出相对较低的毒性（IC50= 220.7 ± 4.0 μg/mL），选择性指数（SI）为8.24。化合物11、17e和18b也显示出相似的选择性特征。
分子建模研究
化学相似性分析
对17个新香豆素衍生物、58个共结晶配体及20个其他配体进行了Tanimoto相似性分析。二维相似性图谱显示，新香豆素形成了一个独特且结构同质的簇，与化学多样性更高的共结晶参比配体明显分离。这表明该香豆素系列在每种拓扑异构酶内会表现出相对一致的结合行为。基于SkelSpheres描述符的图谱有助于识别每个物种中与优先香豆素最相似的共结晶配体，从而为选择可能呈现相关结合位点构象的晶体结构提供了依据。
靶标比对与药效团残基保守性
对选定的细菌DNA促旋酶、拓扑异构酶IV结构中的GyrB和ParE结构域以及全长人源拓扑异构酶IIα序列进行了多序列比对。尽管ATP酶结构域的整体折叠在三种酶类别中高度保守，但几个配体接触残基在细菌同源物中显示出中度到高度的保守性，而在人类对应物中保守性较低。值得注意的是，位于催化腔深处的SVV基序中的丝氨酸残基就是细菌特异性保守的一个例子。结合位点残基的这种差异强化了合理设计对细菌与人类靶标具有定制选择性的配体的潜力。
靶标复合物中的无序性评估
对选定复合物的B因子可视化分析显示，人源拓扑异构酶IIα晶体结构6ZY8的ATP酶结构域存在显著无序，因此将其从后续对接研究中排除。在其他靶标（如1S14）中观察到的高B因子被记录为可能增加重对接验证期间RMSD值的因素。
分子对接与结合亲和力估算
对五个优先的噻唑-腙-香豆素衍生物（11、13、17c、17e、18b）在七个代表ATP结合口袋的晶体结构中进行了分子对接。对接方案通过将天然共结晶配体重对接回其各自的蛋白质中进行验证，产生的RMSD值大多低于3 ?。最大的偏差出现在大肠杆菌拓扑异构酶IV结构（1S14）中，视觉检查表明偏差主要局限于配体的溶剂暴露尾部区域，该区域已知具有高灵活性和高B因子值。
对接结果表明，香豆素衍生物在细菌酶的ATP结合裂缝内具有一致的结合几何形状。香豆素核心通常位于口袋深处（除了在金黄色葡萄球菌ParE模型中），通过与保守残基的疏水接触以及涉及香豆素环羰基和腙连接体亚胺氮的氢键来稳定。噻唑-腙末端的取代基向裂缝的溶剂可及入口延伸，与包含保守GxGxP基序的柔性表面环形成额外的极性接触。
在测试的化合物中，13和17c在细菌靶标中 consistently 表现出最有利的对接分数和MM/GBSA结合自由能，这与它们实验测得的抗菌活性相关。化合物13对金黄色葡萄球菌靶标表现出特别有利的结合，与其强效的体外抗葡萄球菌活性一致。化合物17e显示出中等至良好的对接分数和可变的MM/GBSA值，表明具有物种特异性优化的潜力。化合物18b虽然在某些模型中得分较低，但在铜绿假单胞菌GyrB和金黄色葡萄球菌ParE中获得了最高的结合能，表明该化合物可能具有独特的结合特征。
对人源拓扑异构酶IIα（1ZXM）的预测结合亲和力对所有化合物也相对较高，特别是化合物13，这与其观察到的体外抗癌活性一致。重要的是，参比配体腺苷酰亚胺二磷酸（AMP-PNP）的结合亲和力明显更强，这表明五种先导香豆素具有合理的治疗窗口，这一点进一步得到了它们对健康人肺成纤维细胞有限细胞毒性的支持。
分子动力学模拟
为了进一步研究化合物13与金黄色葡萄球菌GyrB（PDB ID：6TCK）复合物的稳定性和动态行为，进行了100 ns的分子动力学模拟。系统迅速达到平衡，蛋白质主链RMSD在前5 ns后稳定在1.0至1.7 ?之间。配体RMSD在整个模拟过程中保持在2.0–2.8 ?以内，表明在ATP结合口袋内持续保留。均方根涨落分析显示结合位点区域流动性低，支持在整个轨迹中构象稳定且刚性的结合环境。
值得注意的是，分子动力学模拟揭示了化合物13的香豆素内酯部分与残基SER129之间的一个新氢键，该氢键在初始对接姿势中不存在。这种相互作用代表了一种独特的稳定机制，是化合物13所特有的，在以前的香豆素类似物的结合谱中未见报道。与SER129的氢键在整个轨迹中 consistently 被观察到，表明了一种动态重排，增强了结合稳定性的焓贡献。此外，还观察到与位于ATP结合裂缝入口两侧的ARG144和GLY85骨架存在持续的相互作用。这些残基与化合物13的噻唑-腙取代基频繁发生氢键和极性接触，进一步锚定了配体。结合口袋在整个模拟过程中保持了其紧凑且溶剂屏蔽的几何形状，为配体结合提供了一致的环境。
预测的ADMET性质
使用SwissADME和ProTox 3.0对化合物13的药代动力学和毒性特征进行了计算机模拟评估。SwissADME预测其胃肠道吸收低，无血脑屏障渗透性，这可能有助于最大限度地减少中枢神经系统相关的脱靶效应。该化合物未预测到与主要细胞色素P450同工酶（CYP1A2、CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4）的抑制性相互作用，表明代谢性药物-药物相互作用风险低。化合物13满足关键的类药性标准，仅因分子量超过500 Da而违反利平斯基五规则中的一项。虽然未检测到PAINS警报，但识别出三个Brenk结构警报，具体针对香豆素支架、亚胺部分和硫羰基，在后续先导优化中需注意以减少潜在的毒性或不稳定性。ProTox 3.0将化合物13归类为毒性IV级物质，预测啮齿动物口服LD50为1000 mg/kg，表明急性毒性低。在评估的15个毒理学终点中，有6个被预测为具有中等置信度的活性：肝毒性、肾毒性、呼吸毒性、致癌性、血脑屏障干扰和芳烃受体激活。所有剩余终点，包括致突变性和细胞毒性，均被预测为无活性。
结论
本研究成功设计、合成并评估了一系列新型噻唑-腙-香豆素衍生物作为双效抗癌和抗菌剂。生物学评价确定化合物13为最具潜力的先导分子，其对HeLa癌细胞表现出强效细胞毒性（IC50= 26.8 μg/mL），同时对WI-38正常细胞具有较高的选择性（SI = 8.24）。在抗菌方面，化合物13对包括MSSA、MRSA和VRSA在内的金黄色葡萄球菌菌株以及多种革兰氏阴性病原体（如铜绿假单胞菌、大肠杆菌）均表现出纳摩尔级的强效且广谱的活性。计算模拟研究为其作用机制提供了分子层面的深入见解：分子对接和MM/GBSA分析表明这些化合物能有效结合细菌DNA促旋酶（GyrB）、拓扑异构酶IV（ParE）及人源拓扑异构酶IIα的ATP结合口袋，解释了其双效活性。特别重要的是，分子动力学模拟揭示化合物13与金黄色葡萄球菌GyrB的SER129残基之间形成了一个新颖且稳定的氢键，这可能是其卓越抗菌活性的结构基础。ADMET预测表明化合物13具有合理的药代动力学和安全特性。综上所述，噻唑-腙-香豆素杂化体，特别是化合物13，代表了一类有前途的双效先导化合物，为开发治疗免疫功能低下癌症患者合并感染的新疗法奠定了坚实基础。未来的研究将围绕对此类先导化合物进行结构优化以进一步提高效力和选择性，并开展更深入的临床前体内药效和安全性评估。
