《Scientific Reports》：A scanning electron microscopy—based approach to explore subpodocyte space remodeling in diabetic kidneys of mice and humans
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为解决传统透射电镜分析足细胞下间隙(SPS)依赖灌注固定、无法适用于临床活检样本的局限性，本研究开发了一种基于二次电子检测的快速扫描电镜(SEM)方案，专门针对非灌注样本优化。研究人员在健康与糖尿病(BTBR ob/ob)小鼠中，对比了灌注与非灌注肾脏，证实该方法能准确评估SPS形态。该方案成功应用于对照与糖尿病患者的人肾活检样本，实现了对整个肾小球横截面的可靠SPS评估与超微结构分析。此优化方案为SPS分析提供了可靠且通用的方法，拓宽了其在临床相关场景中的应用。
糖尿病肾病是导致终末期肾病的主要原因之一，而足细胞损伤在其中扮演了关键角色。在足细胞紧贴的肾小球基底膜上方，存在着一个被称为足细胞下间隙的微小空腔。这个不起眼的空间，其大小和形态的改变，被认为是肾小球功能异常的早期标志。长期以来，科学家们依赖透射电子显微镜来窥探这个微观世界。然而，透射电镜观察往往需要事先对肾脏进行灌注固定，这在动物模型中可行，但在进行诊断性穿刺活检的患者身上，却是一个无法实现的步骤。这个技术鸿沟，阻碍了我们对人类糖尿病肾病早期足细胞下间隙变化的深入理解，也限制了对该标志物的临床转化应用。因此，开发一种能够直接适用于临床常规肾活检样本、并能对足细胞下间隙进行可靠评估的新技术，成为了一个迫切的需求。为了攻克这一难题，一个研究团队开展了一项创新性工作，旨在建立一种基于扫描电镜的新方法，以突破传统技术的限制，相关成果已发表在《Scientific Reports》期刊上。
为了开展这项研究，研究人员主要采用了优化的扫描电子显微镜技术。他们开发了一套基于二次电子检测的快速扫描电镜方案，专门为非灌注固定的样本（如临床肾活检标本）而优化。研究采用了配对实验设计，在健康小鼠和糖尿病（BTBR ob/ob）小鼠模型中，对比分析了经灌注固定和对侧非灌注固定肾脏的足细胞下间隙。最后，该方案被成功应用于来自对照组和糖尿病患者的实际人类肾活检样本，以验证其临床适用性。
Abstract
本研究旨在建立一种适用于非灌注样本的扫描电镜方法，以评估足细胞下间隙。通过比较小鼠灌注与非灌注肾脏，验证了该方法评估足细胞下间隙形态的准确性，并成功将其应用于人肾活检样本，实现了对足细胞下间隙的可靠分析。
Results
Comparison of SPS morphology and quantification between perfused and non-perfused kidneys in mice.
研究人员首先在小鼠模型中验证新方法的可靠性。他们比较了健康小鼠和糖尿病（BTBR ob/ob）小鼠经灌注固定与非灌注固定（对侧肾脏）的样本。扫描电镜图像显示，即使在非灌注条件下，肾小球足细胞及其初级和次级足突的精细结构，以及关键的足细胞下间隙形态都得以清晰保留。通过形态计量学分析发现，无论是健康组还是糖尿病组，灌注与非灌注肾脏样本之间测得的足细胞下间隙面积参数均无显著差异。这一关键结果证实，新开发的基于二次电子检测的扫描电镜方案，在缺乏灌注固定的情况下，依然能够准确、可靠地对足细胞下间隙进行形态学观察和定量分析，从而解决了动物模型研究向临床转化中的一个核心技术瓶颈。
Application of the SEM protocol to human kidney biopsies.
在成功验证小鼠模型的有效性后，研究人员将这一优化的扫描电镜方案应用于真实世界的人类肾活检样本。他们分析了来自对照组个体和糖尿病肾病患者的肾组织。扫描电镜成功地捕获了整个肾小球横截面的超微结构细节。图像清晰显示了人类肾小球中足细胞的复杂三维结构、基底膜以及位于两者之间的足细胞下间隙。更重要的是，该方法能够区分不同临床状态样本中足细胞下间隙的形态差异，实现了在临床常规获得的、未经灌注固定的活检组织上进行可靠的足细胞下间隙评估和超微结构分析。这标志着该方法完全适用于临床场景，为直接研究人类疾病样本中的足细胞下间隙变化打开了大门。
Discussion
本研究的核心是开发并验证了一种创新的扫描电子显微镜方案，该方案专门为分析非灌注固定的组织样本（特别是临床肾活检标本）中的足细胞下间隙而优化。研究通过严谨的配对实验设计，首次系统证明了在没有灌注固定的条件下，使用基于二次电子检测的扫描电镜，依然能够获得与金标准方法（灌注固定后观察）相一致的、准确的足细胞下间隙形态学和定量数据。这一突破性进展成功弥合了临床前研究与临床研究之间的技术鸿沟。
该方案的成功应用具有多重重要意义。首先，它极大地拓宽了足细胞下间隙研究的适用范围，使其从依赖灌注的动物实验，直接延伸至可直接分析的人类患者活检组织。这使得研究者能够在更贴近真实疾病状态的样本上，探索足细胞下间隙在糖尿病肾病等疾病发生发展中的动态变化和临床意义。其次，这种能够处理常规临床样本的能力，为将足细胞下间隙作为一个潜在的早期生物标志物用于临床评估和诊断提供了坚实的技术基础。医生未来或许能够通过分析活检样本中的这一微观结构，更早地识别出有肾功能下降风险的患者。最后，该方法所提供的高分辨率、大视野的超微结构图像，不仅能用于足细胞下间隙分析，还能同时评估肾小球内其他结构的病理改变，如足突融合、基底膜增厚等，为全面理解肾小球损伤提供了强有力的工具。综上所述，这项研究提供的优化扫描电镜协议是一个可靠且通用的平台，它将基础研究发现向临床转化应用的通道变得更为顺畅，有望推动对糖尿病肾病等肾小球疾病病理机制的深入理解和诊疗策略的创新。
