基于外显子引物内含子跨越标记技术对东非罗非鱼物种的交叉扩增应用及遗传多样性评估

《Ecology and Evolution》：Application of Exon Primed Intron Crossing Markers to Cross-Amplify Oreochromis Species in Eastern Africa

本综述聚焦于外显子引物内含子跨越（EPIC）标记技术在评估东非重要经济鱼类——罗非鱼属物种遗传多样性方面的应用。研究成功开发了针对免疫相关基因的EPIC标记，实现了在四种罗非鱼物种间的交叉扩增。通过分析来自11个自然水体及2个养殖场的种群，揭示了物种间显著的遗传分化、种群结构以及基因流动模式。这项工作为监测生物多样性、支持罗非鱼物种的保护性养殖和可持续管理提供了有力的分子工具。

　　

基于外显子引物内含子跨越标记技术对东非罗非鱼物种的交叉扩增应用及遗传多样性评估

引言

渔业和水产养殖是全球动物蛋白的重要来源，对保障粮食安全、营养和生计至关重要。在东非，罗非鱼是内陆捕捞渔业和水产养殖的核心鱼种，因其生态适应性强、经济价值高而在整个非洲的热带生态系统中扮演关键角色。罗非鱼主要属于三个属，其中罗非鱼属物种尤为突出，它们能适应多样化的环境，繁殖效率高，食性策略灵活，这支持了其被全球引种。然而，野生罗非鱼种群正日益受到人为活动的影响，包括人为迁徙、水产养殖引种和栖息地改变。这些过程可能改变种群的遗传多样性和连通性模式，导致本地适应性基因库的侵蚀。为了支持可持续水产养殖管理和野生鱼类的保护，需要能够监测种群结构和遗传多样性的分子工具。

传统的中性分子标记，如微卫星，因其多态性而被广泛应用于罗非鱼种群结构和遗传多样性研究。然而，其应用常受限于开发物种特异性标记的高成本，且由于引物错配和序列分歧，在跨物种扩增方面成功率有限，限制了其在缺乏参考基因组的多个类群或种群中进行比较研究的适用性。相比之下，外显子引物内含子跨越标记则提供了一个强有力的替代方案。EPIC标记被设计为扩增包含可变内含子的保守外显子区域，能够实现可靠的跨物种扩增，同时捕获适用于种群水平分析的序列变异性。与中性微卫星相比，EPIC标记不仅能交叉扩增不同类群，而且靶向的基因区域更可能参与对选择压力的适应性反应。

本研究旨在：1) 开发和验证用于跨物种扩增的EPIC标记；2) 描述遗传变异和种群结构模式；3) 为未来罗非鱼物种保护的种群遗传学研究提供分子工具。通过使用EPIC标记，这种方法克服了物种特异性微卫星的局限性，为跨罗非鱼物种的比较分析提供了工具，支持东非地区的保护和资源管理。

材料与方法

本研究利用了先前采集的DNA样本，覆盖了东非多个湖泊和渔场。样本总数为296个，包括来自15个种群的226尾尼罗罗非鱼个体、36尾食用罗非鱼个体、11尾吉佩罗非鱼个体和23尾白点罗非鱼个体。采样点基于生态重要性、目标物种的存在以及本地和引进种群的代表性而选择。

EPIC标记设计与开发

EPIC标记的设计基于尼罗罗非鱼的参考基因组，针对免疫相关基因。通过比较基因组的mRNA序列来确定外显子位置和间隔的内含子区域。引物设计使用Primer3程序，参数优化包括引物长度、GC含量、预期扩增子大小和最佳退火温度。首先通过单重PCR评估每个引物对的适用性，从65对初始引物中筛选出50对在目标扩增子长度下产生清晰、特异性条带的引物用于下游分析。引物被分成四个组合，用于后续的多重扩增子分型。

样品收集与制备

样本来自乌干达、埃塞俄比亚和肯尼亚的多个自然湖泊以及乌干达的两个养殖场。在乌干达，尼罗罗非鱼样本采自维多利亚湖、基奥加湖、阿尔伯特湖和乔治湖；食用罗非鱼和白点罗非鱼分别采自比西纳湖和基奥加湖。在埃塞俄比亚，尼罗罗非鱼采自塔纳湖、查莫湖和哈申盖湖。在肯尼亚，尼罗罗非鱼采自图尔卡纳湖和吉佩湖，食用罗非鱼采自卡尼亚博利湖，吉佩罗非鱼则采自吉佩湖。此外，乌干达的卡詹西和基亚纳米拉养殖场代表了养殖种群。

多重扩增子分型与测序

使用机器人液体处理系统在384孔PCR板中制备PCR反应混合液。PCR扩增使用Qiagen多重PCR试剂盒完成。得到的扩增子被合并并用磁珠纯化。文库索引遵循既定程序。索引后的文库在Illumina MiSeq平台上进行双端测序。

群体遗传学分析

使用Trimmomatic和USEARCH软件对测序数据进行质量评估和预处理，包括修剪低质量reads和合并正反向序列。清洁后的读长使用SSR-GBS流程进行处理，该流程最初为微卫星标记设计，但经过调整以容纳EPIC标记，最终生成用于后续分析的基因型矩阵。在分析前，去除了缺失基因型超过50%的样本和失败率超过50%的标记。

结果与分析

EPIC标记的扩增成功率

50个EPIC标记在尼罗罗非鱼和其他罗非鱼物种中成功产生高质量的扩增。因缺失数据率高于50%，5个标记和24个样本被过滤掉，最终得到一个包含45个标记和272个个体的矩阵。

罗非鱼物种及其种群的遗传多样性

在研究的物种中观察到了种间遗传多样性差异。总体而言，物种水平（预期杂合度He=0.33，观察杂合度Ho=0.35）和种群水平（He=0.3， Ho=0.36）的杂合度值为中等。在物种中，尼罗罗非鱼表现出最高的杂合度（He=0.50），其次是吉佩罗非鱼（He=0.29）、白点罗非鱼（He=0.28）和食用罗非鱼（He=0.25）。在野生种群中，来自肯尼亚图尔卡纳湖的尼罗罗非鱼杂合度最高（He=0.49），而来自埃塞俄比亚哈申盖湖的种群杂合度最低（He=0.14）。在维多利亚湖盆地内，维多利亚湖的多样性高于卡詹西养殖场。在两个养殖种群中，基亚纳米拉的杂合度高于卡詹西。在埃塞俄比亚种群中，查莫湖的杂合度最高，塔纳湖和哈申盖湖较低。总体固定指数在种群间为负值。

罗非鱼物种间的遗传分化

罗非鱼种群间的成对遗传分化值范围在0.02到0.73之间。最高的值出现在不同物种的种群之间，例如吉佩湖的吉佩罗非鱼和尼罗罗非鱼之间，以及基奥加湖的尼罗罗非鱼和白点罗非鱼之间。在种内水平，两个食用罗非鱼种群表现出中低水平的遗传分化。总体而言，尼罗罗非鱼种群之间的分化较低，尤其是在维多利亚湖和卡詹西养殖场、卡詹西和基亚纳米拉养殖场、基亚纳米拉和阿尔伯特湖、基奥加湖和维多利亚湖等种群之间。埃塞俄比亚的塔纳湖、查莫湖和哈申盖湖的尼罗罗非鱼种群之间表现出中等到非常高的遗传分化。

分子方差分析显示了高水平的种间分化，47%的遗传变异归因于物种间的差异。物种内种群间的分化占17%，种群内个体间的差异占31%。

罗非鱼物种及其种群的种群结构

主坐标分析揭示了清晰的聚类模式。考虑所有物种时，观察到四个主要聚类，与物种边界一致。聚焦于尼罗罗非鱼种群，观察到五个主要的独立聚类：1) 查莫湖和哈申盖湖种群；2) 图尔卡纳湖种群；3) 吉佩湖种群；4) 塔纳湖种群；5) 乌干达种群。乌干达水体的尼罗罗非鱼主坐标分析没有显示出任何明显的聚类模式。对食用罗非鱼在比西纳湖和卡尼亚博利湖的进一步分析表明，两个种群之间存在分离。在同一水体中同时出现的不同物种的个体按照物种边界进行聚类。主成分分析表明，超过50%的EPIC标记对观察到的罗非鱼物种间遗传变异有贡献，前两个主成分解释了总遗传变异的36%。

邻接树和UPGMA分析显示出与主坐标分析结果高度一致的聚类模式。每个物种都清楚地相互分离。乌干达的尼罗罗非鱼种群形成一个聚类，图尔卡纳湖的尼罗罗非鱼和吉佩湖的吉佩罗非鱼形成独立的聚类，而查莫湖和哈申盖湖的尼罗罗非鱼聚集在一起，与塔纳湖种群独立。

罗非鱼物种及其种群的混合水平

贝叶斯结构分析揭示了所采罗非鱼种群间清晰的遗传聚类模式。包含所有个体的分析，最优K值为8。结构分析显示，尼罗罗非鱼的卡詹西、基亚纳米拉和图尔卡纳湖种群之间观察到混合。聚类总体上与主坐标分析结果一致，物种间没有混合。对尼罗罗非鱼的进一步结构分析确定了最优K值。观察到五个不同的组，这与邻接树的结果相似。来自图尔卡纳湖、维多利亚湖以及养殖场的尼罗罗非鱼种群表现出较高的混合水平，而食用罗非鱼、吉佩罗非鱼和白点罗非鱼没有显示任何混合。

讨论

罗非鱼物种的遗传多样性与种群结构

罗非鱼物种的遗传多样性受多种因素影响，包括杂交、样本量、有效种群大小、环境适应、华伦效应、近交、隔离打破效应和种群混合。本研究结果表明，与其他罗非鱼物种相比，尼罗罗非鱼保持了更高的遗传多样性。吉佩罗非鱼、食用罗非鱼和白点罗非鱼的低遗传多样性可归因于相对较小的湖泊面积，这些湖泊往往支持规模较小且通常孤立的鱼类种群，加之强烈的捕捞压力进一步加速了种群数量下降，可能导致有效种群规模缩小和近交。

种群结构与物种隔离

多变量分析一致表明，每个物种形成一个独立的聚类，但尼罗罗非鱼种群内部又形成了反映地理起源的子聚类。物种水平的清晰分离表明所研究的罗非鱼物种之间存在生殖隔离。同一水体中尼罗罗非鱼与白点罗非鱼，以及尼罗罗非鱼与吉佩罗非鱼的明显分离，表明这些同域物种保持了独特的基因库，这很可能是由于生态位分化所致。物种间不同的栖息地偏好可能导致生态分离。

尼罗罗非鱼种群形成清晰的区域聚类，表明自然地理屏障和历史隔离维持了图尔卡纳、吉佩、塔纳、查莫和哈申盖等种群的种群结构。相比之下，乌干达尼罗罗非鱼种群之间缺乏明显聚类，表明存在显著的基因流或共同的起源，这可能反映了广泛的人为迁徙、放养以及孵化场和野生种群的混合。湖乔治的尼罗罗非鱼种群在邻接树中与乌干达主群略有分离，暗示了可能由于有限的基因流或局部适应导致的细微分化。尽管地理位置不同，但卡尼亚博利湖和比西纳湖的食用罗非鱼种群之间遗传分化较低，这可能归因于人为迁徙或共同的来源保持了相似的基因库。需要注意的是，本研究中观察到的种内结构水平较低，可能与EPIC标记的保守性有关，与微卫星相比，其变异性较低，可能因此忽略了一些种内分化模式。

罗非鱼物种的遗传分化与混合水平

遗传分化量化了种群或物种间等位基因频率的分化程度，为理解基因流、遗传漂变和选择等进化过程提供了见解。本研究中的成对F_ST值范围很广，物种间和部分种群间表现出高到非常高的遗传分化，突出了显著的生殖隔离。然而，乌干达尼罗罗非鱼种群间的低F_ST值反映了持续的基因流，这既由自然水体连通性造成，也由东非地区已知的大范围人为迁徙所致。同时，卡尼亚博利湖和比西纳湖的食用罗非鱼种群显示出中低水平的遗传分化，表明存在部分隔离。

EPIC标记的保护应用价值

本研究中使用的EPIC标记显示出较高的跨物种扩增成功率，能够在尼罗罗非鱼、吉佩罗非鱼、食用罗非鱼和白点罗非鱼之间进行比较分析。这是首批全面应用EPIC标记评估非洲罗非鱼属物种遗传多样性和种群结构的研究之一。50个标记中有45个在多个物种中成功扩增，突显了它们在跨物种扩增以及非模式生物功能相关性研究中的价值。EPIC标记来源于侧翼包含内含子的保守外显子区域，这使得它们能够靶向可变的内含子序列，从而支持遗传分化分析。与微卫星等中性标记主要描述背景种群结构不同，EPIC标记更可能表现为非中性，能够捕获由选择压力塑造的适应性变异和进化潜力。

结论

EPIC标记的跨物种扩增能力使得精细解析种群结构和混合模式成为可能。它们的高跨物种转移性以及准确揭示种间和种内模式的能力，强调了它们在保护和水产养殖育种计划中的重要性。本研究揭示了东非罗非鱼物种间存在高遗传多样性和分化，其清晰的种群结构由地理隔离、历史连通性和人为活动共同塑造。

在许多尼罗罗非鱼种群中观察到的低到中等水平的遗传分化反映了持续的基因流和混合，这很可能是由自然扩散和大规模与水产养殖相关的人为迁徙驱动的。吉佩罗非鱼、白点罗非鱼和食用罗非鱼物种之间的高度分化表明存在强大的生殖屏障和有限的杂交。

总体而言，研究结果强调了改进水产养殖管理实践的必要性。保护工作应优先考虑遗传上独特和孤立的种群，以保护生物多样性和维持生态系统健康。未来的研究结合中性和EPIC标记，将进一步为东非罗非鱼物种的可持续管理策略提供信息。此外，应深入研究这些标记在种群水平上揭示免疫基因适应性变异的能力。