《Ecology and Evolution》：Effects of Age, Sex, and Social Network on Antibiotic Resistance Genes in the Gut Microbiome of Tibetan Macaques (Macaca thibetana)
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本文综述深入探讨了黄山野生藏酋猴肠道微生物组中抗生素抗性基因（ARGs）的组成、丰度及调控因素。研究发现其肠道ARGs多样性高，以多重耐药、糖肽类和肽类抗性基因为主。宿主年龄、性别和社会网络虽不影响总体ARGs多样性，但显著影响多个高丰度ARGs（如gryB, rpoB, macB, novA等）的相对丰度。文章揭示了肠道细菌与ARGs间存在广泛的相互作用，且年龄是驱动其共变的关键因素。这些发现为理解社会性灵长类野生动物肠道抗生素抗性的形成与传播机制提供了新视角。
引言
抗生素在畜牧业和人类医疗中的广泛应用导致了临床上重要抗生素抗性的出现与传播，这已成为一个紧迫的全球公共卫生问题。耐药病原体的快速进化正在逐渐削弱现有抗生素的疗效，从而削弱了我们有效治疗细菌感染的能力。哺乳动物的肠道是抗生素抗性基因（ARGs）的重要储存库，这些基因可以通过水平基因转移（HGT）转移到病原体。ARGs通过农业径流、废水排放和动物粪便进入环境，在那里积累并随后被野生动物通过觅食、饮水和栖息地使用而获得。除了减少治疗选择和增加来自机会性耐药病原体的感染风险外，ARGs还通过多种机制对野生动物的免疫功能构成系统性威胁。作为自然生态系统的组成部分，非人灵长类动物在进化上是人类的近亲，其肠道微生物组在营养代谢和免疫调节等关键领域表现出与人类显著的功能相似性，使其成为研究ARGs生态和健康影响的理想模型。目前，针对非人灵长类动物（NHPs）ARGs的研究相对有限，主要集中在圈养与野生种群之间的比较、ARGs分布的地理变异以及饮食因素对肠道抵抗组的影响。黄山藏酋猴是中国特有的灵长类动物，隶属于灵长目猴科猕猴属。本研究对黄山藏酋猴的粪便样本进行宏基因组测序，以表征其肠道微生物组和抵抗组。
材料与方法
样品收集与行为数据收集
自1983年起，研究团队对黄山浮溪野猴谷的鱼鳞坑YA1群进行了连续的行为监测和生态学研究。所有个体都已被充分习惯化且可唯一识别，并建立了谱系关系。该猴群在固定地点每天接受三次玉米投喂，约占其总饮食摄入量的三分之一；其余部分为天然可得的野生植物。为了最大限度地减少潜在的季节性影响，于2024年7月至8月期间从YA1群的已识别个体收集新鲜粪便样本。共收集了21份成年个体的粪便样本纳入最终分析；所有被采样的雌性个体均非怀孕或哺乳期，排除了即时生殖状态的影响。在研究期间（2024年7月至8月），每日从08:00至17:00使用焦点动物取样法追踪和观察猴群。本研究获得了安徽省动物学会动物护理和使用委员会的批准。
宏基因组分析、分类注释、组装和功能预测
从粪便样本中提取基因组DNA。使用Illumina NovaSeq X Plus平台进行宏基因组测序。原始读段经过严格的质量控制和过滤。为了最大限度地减少宿主来源的污染，质量过滤后的数据与藏酋猴参考基因组比对，并去除宿主序列。使用MEGAHIT对高质量测序读段进行从头组装，保留长度≥300 bp的连续序列用于后续分析。使用Prodigal从组装的连续序列中预测开放阅读框（ORFs）。使用CD-HIT对所有样本的基因序列进行聚类。然后，将每个样本的高质量读段与该目录比对，并基于读段覆盖率估算基因丰度。使用Diamond软件将非冗余基因目录的氨基酸序列与NR和CARD数据库进行比对。使用抗生素抗性本体（ARO）注释抗生素抗性基因。基于CARD中的“抗性机制”注释识别抗性机制。
社会网络数据处理
梳理行为旨在加强个体之间的亲和关系。梳理指数（GI）基于个体之间的梳理持续时间计算。使用R软件，基于所得的GI矩阵计算了所有21个个体的宿主特征向量中心度系数。宿主特征向量中心度系数反映了个体在社会网络中的相对重要性：较高的值表示更频繁的社会互动、更强的亲和倾向或在群体结构中更核心的地位。
数据分析
本研究中的所有统计分析均在R中进行。使用TPM（每百万转录本）计算微生物相对丰度，同时使用PPM（百万分之几）量化ARGs的相对丰度。采用≥1%的平均相对丰度作为高丰度ARGs的阈值，以最大限度地减少稀有序列噪音，同时保留潜在的功能基因。使用Sobs指数（观察到的物种丰富度）和Shannon指数（群落多样性）评估肠道细菌群落的α多样性。对于β多样性，使用QIIME生成Bray–Curtis距离矩阵。本研究采用了混合方法，整合了假设驱动和探索性分析。应用广义线性模型（GLMs）评估宿主年龄和宿主特征向量中心度对藏酋猴肠道微生物组中ARGs多样性的影响，使用Sobs指数、Shannon指数和β多样性指数作为响应变量。预测因子包括宿主年龄、性别和梳理网络的特征向量中心度。年龄和特征向量中心度在进入GLMs之前进行了z标准化。性别被视为二元因子。使用Wilcoxon秩和检验识别性别组之间差异丰度的微生物和ARGs，随后使用Benjamini–Hochberg程序进行错误发现率（FDR）校正。使用Spearman秩相关检验评估与宿主年龄和特征向量中心度系数的关联。使用R中的ggplot2包进行数据可视化，包括堆叠条形图、主坐标分析（PCoA）和热图。将细菌和ARGs的丰度数据归一化为相对丰度。作为探索性分析，构建了共现网络，以可视化肠道细菌和ARGs之间潜在的相互作用模式。网络基于细菌类群和ARGs相对丰度得出的Spearman相关系数，边和节点由显著相关性定义。重要的是，该网络分析本质上是探索性的，旨在为未来的假设驱动测试确定候选关系和模式。使用Gephi版本0.10.1可视化网络拓扑结构。整个分析采用p < 0.05的统计显著性阈值。
结果
藏酋猴肠道微微生物组中抗生素抗性基因的组成
总共鉴定出1027个不同的ARGs，分布在35个抗性类别中。多重耐药基因最为丰富，占总ARGs的33.72% ± 0.75%，其次是糖肽抗性基因（13.17% ± 0.76%）和肽类抗性基因（11.71% ± 0.41%）。在基因水平上，基于平均相对丰度阈值≥1%，定义了26个高丰度ARGs。其中包括macB（3.06% ± 0.19%）、efrA（2.32% ± 0.22%）和带有突变赋予夫西地酸抗性的金黄色葡萄球菌fusA（fusA (mut), 2.18% ± 0.09%）等。在抗性机制方面，大多数ARGs与抗生素靶点改变（47.53% ± 1.60%）和抗生素外排（39.21% ± 1.73%）相关。
性别、年龄和社会网络对ARG组成和多样性的影响
本研究检查了宿主性别、年龄和特征向量中心度系数与已鉴定的26个高丰度ARGs之间的关联。使用Wilcoxon秩和检验配合BH-FDR校正进行的雌雄组间差异丰度分析，揭示了四个具有统计学显著差异的ARGs（p < 0.05）。这些包括赋予氟喹诺酮抗性的艰难梭菌gryB（p = 0.0159）、带有突变赋予利福平抗性的艰难梭菌rpoB（p = 0.0197）、macB（p = 0.0242）和novA（p = 0.0159）。这四个ARGs在雄性个体中的相对丰度显著高于雌性。
ARG相对丰度与年龄之间的Spearman秩相关分析确定了四个与年龄显著相关的基因（p < 0.05）。三个ARGs表现出负相关：efrA（R = ?0.69, p = 7.1 × 10?5）、patB（R = ?0.52, p = 0.0057）和赋予莫匹罗星抗性的金黄色葡萄球菌mupA（R = ?0.57, p = 0.0019）。只有RanA与年龄呈显著正相关（R = 0.44, p = 0.02）。
类似地，ARG丰度与宿主特征向量中心度系数之间的相关性分析确定了两个具有显著负相关的基因：cdeA（R = ?0.44, p = 0.045）和带有突变赋予夫西地酸抗性的金黄色葡萄球菌fusA（R = ?0.49, p = 0.023）。
GLM分析表明，基于Sobs指数、Shannon指数和β多样性等指标，藏酋猴肠道微生物组中ARGs的多样性与宿主年龄、性别或特征向量中心度系数等因素之间未观察到显著关联（所有p > 0.05）。
肠道细菌与ARGs之间的关联
藏酋猴的肠道细菌群落主要由两个门主导：厚壁菌门（65.82% ± 7.04%）和拟杆菌门（20.23% ± 5.66%）。核心细菌属被定义为在超过90%的粪便样本中检测到且平均相对丰度大于1%的属。鉴定出16个这样的核心属：普雷沃氏菌属、梭菌属、颤螺菌属、瘤胃球菌属、密螺旋体属、另枝菌属、真杆菌属、螺杆菌属、粪杆菌属、布劳特氏菌属、罗斯氏菌属、拟杆菌属、塞加氏菌属、假黄杆菌属、Candidatus Avoscillospira和支原体属。其中，普雷沃氏菌属（9.62% ± 3.88%）、梭菌属（9.34% ± 4.03%）和颤螺菌属（6.65% ± 1.90%）最为丰富。
作为探索性方法，属水平的共现网络分析揭示了藏酋猴肠道微生物组中细菌和ARGs之间广泛的潜在相互作用。在网络中，ARGs占节点的52.79%，而细菌类群占47.21%。在所有相互作用中，67.76%是正相关，32.24%是负相关。基于节点度中心性，ARG-细菌网络中的核心节点是托马斯梭菌属（度 = 50）、vanF簇中的vanZ基因（度 = 44）和厌氧丁酸菌属（度 = 40）。在按度排序的前10个节点中，只有三个是ARGs：vanZ基因（度 = 44）、rosB（度 = 34）和vanP簇中的vanS基因（度 = 34）。值得注意的是，vanZ和vanS基因都参与糖肽抗性，而rosB赋予肽类抗生素抗性。
在本研究中，未观察到细菌多样性与ARGs丰度之间的显著相关性。使用一致的分析方法，我们进一步评估了宿主性别、年龄和特征向量中心度系数对肠道细菌α和β多样性的影响。结果表明，宿主年龄和宿主特征向量中心度系数对细菌多样性均无显著影响。与ARGs分析一致，我们使用Wilcoxon秩和检验配合BH-FDR校正和Spearman秩相关来识别与宿主性别、年龄和特征向量中心度系数相关的核心细菌属。四个核心属在性别间显示出显著差异：罗斯氏菌属（p = 0.0159）、颤螺菌属（p = 0.0197）、Candidatus Avoscillospira（p = 0.0242）和瘤胃球菌属（p = 0.0295）。五个核心属与年龄显著相关：另枝菌属（R = 0.55, p = 0.003）、拟杆菌属（R = 0.47, p = 0.013）、梭菌属（R = ?0.60, p = 0.00093）、支原体属（R = ?0.55, p = 0.00293）和罗斯氏菌属（R = 0.44, p = 0.022）。两个属与宿主特征向量中心度系数显著相关：另枝菌属（R = 0.44, p = 0.046）和真杆菌属（R = ?0.46, p = 0.038）。
然后，我们检查了与宿主性别、年龄或特征向量中心度系数显著相关的核心属和高丰度ARGs是否也作为相关对出现在共现网络中。未发现与宿主性别不同的细菌和ARGs之间存在显著相关性。然而，在与宿主年龄相关的五种细菌和四种ARGs中，识别出四个显著的细菌-ARGs对。类似地，在与宿主特征向量中心度系数相关的两种细菌和两种ARGs中，检测到一个显著的相关对。
讨论
本研究重点关注生活在黄山的野生藏酋猴肠道微生物组中的细菌群落和ARGs。研究结果表明，这些藏酋猴肠道中的ARGs主要是多重耐药、糖肽类和肽类抗性基因。这一模式与最近一项关于四川马边自然保护区藏酋猴ARGs的研究一致，但与大多数其他非人灵长类动物研究的结果有显著差异，后者以四环素抗性基因为主。先前的研究表明，四环素类抗生素是农业中使用最广泛和应用量最大的类别之一。在非人灵长类动物中检测到的优势四环素抗性基因与农业动物中流行的基因高度重叠，这可能与农业环境中四环素的历史使用有关。相比之下，多重耐药基因的富集是复杂环境压力和多样化人类活动综合作用的结果。尽管马边没有发展旅游业，但那里的藏酋猴在竹笋采摘等生计活动中，通过作物觅食、捡拾生活垃圾以及与居民的密切接触，经常暴露于复杂的人为污染。类似地，黄山藏酋猴的栖息地受到高强度且特定的人类活动压力，包括游客和周边农民的投喂、丢弃的食品包装以及潜在的人类粪便污染。这些发现共同表明，黄山藏酋猴肠道中独特的多重耐药组主要是由其栖息地与人类居住区重叠导致的复杂生活垃圾暴露所驱动，而非传统的农业抗生素污染。
在动物和人类研究中，年龄和性别等因素已被证明能显著影响ARGs的分布。例如，山羊羔的瘤胃ARGs组成随年龄而变化，其丰富度随着年龄增长而下降。类似地，大熊猫幼崽肠道中ARGs的相对丰度高于成年个体。在人群中，高收入国家的女性表现出显著高于男性的ARGs多样性。然而，在本研究检测的藏酋猴肠道微生物组中，未观察到ARGs总体多样性与宿主性别、年龄或特征向量中心度之间的显著相关性。这表明这些因素可能不是影响野生藏酋猴ARGs多样性的关键决定因素，尽管基于现有数据，这些结果的具体原因尚不清楚。未来的研究应扩大样本量，进行纵向追踪，并将宿主行为观察与环境因素测量相结合，以进一步阐明藏酋猴肠道ARGs多样性动态及其与社会生态变量的关系。
值得注意的是，虽然在总体多样性水平上未观察到显著相关性，但核心ARGs的分布仍受到宿主性别、年龄和社会结构特征的影响。例如，我们发现包括赋予氟喹诺酮抗性的艰难梭菌gryB、带有突变赋予利福平抗性的艰难梭菌rpoB、macB和novA在内的四种高丰度ARGs在雄性个体中显著富集。这一结果表明，性别可能通过调节关键ARGs的丰度，差异化地塑造藏酋猴肠道中的抗菌抗性谱。其中，gyrB和rpoB直接介导对重要临床抗生素的抗性，它们的富集可被视为临床抗性溢出到环境的直接分子证据。macB通常位于可移动遗传元件上，表明存在水平基因转移和多重耐药风险。novA可能作为一种残留或共选择标记持续存在于抗性基因库中。这些ARGs在雄性肠道中的共同出现表明，其肠道可能构成了一个同时容纳历史和新兴抗性机制的微环境，具有基因流动的潜力。这种性别二态性可能与雄性藏酋猴的行为生态学和生理特征有关。行为上，雄性通常拥有更大的家域范围和更高的流动性，更频繁地探索和进入人类活动密集区域，从而增加了他们暴露于环境ARG污染的风险。因此，雄性个体可能扮演着连接人为污染源与猴群内部微生物储存库的关键桥梁。其次，生理差异也可能起到辅助作用：性激素可以通过调节免疫反应和胆汁酸信号通路影响肠道微环境，可能改变耐药细菌的定植效率或质粒转移动态，从而使雄性肠道具有不同的携带或维持特定ARGs的倾向。总之，这项研究表明，雄性藏酋猴可能在种群内扮演抗生素抗性基因的储存库和扩散中心的角色。它们在“一体化健康”框架内的生态功能值得进一步关注。
此外，本研究发现宿主年龄与四种ARGs的相对丰度呈负相关：efrA、patB和赋予莫匹罗星抗性的金黄色葡萄球菌mupA，而与RanA呈显著正相关。我们的部分发现与其他研究的结果一致。例如，关于大熊猫肠道ARGs的研究也报告了efrA基因在老年组中的相对丰度下降。这种与年龄相关的变化可能由多种因素驱动。一方面，伴随免疫功能下降的免疫衰老可能重塑肠道微生物群及其相关抵抗组的结构。另一方面，与年龄相关的微生物组成变化可能直接影响特定ARGs的富集。在山羊瘤胃抵抗组的研究中也有类似现象的报道。同时，本研究还发现cdeA和带有突变赋予夫西地酸抗性的金黄色葡萄球菌fusA的丰度与宿主特征向量中心度系数显著负相关。这表明这些ARGs倾向于在社会网络边缘的个体中富集，而不是在占据中心位置的个体中。这种分布模式可能与ARGs相关的代谢成本有关。编码多药外排泵的cdeA和介导夫西地酸抗性的fusA都需要大量的代谢成本。核心个体为了维持其关键的生态功能，可能倾向于抑制这类高成本抗性基因的积累。相比之下，外围宿主面临更强的环境压力和竞争，这可能限制了它们向网络中心位置移动的生态机会。
研究显示，藏酋猴的肠道细菌群落以厚壁菌门和拟杆菌门为主，几个核心属在维持肠道微生态稳态和功能方面发挥着关键作用。属水平的共现网络分析进一步表明，细菌和ARGs之间存在广泛的正相关和负相关，表明它们之间存在复杂的共同进化和相互作用机制。托马斯梭菌属和vanF簇中的vanZ基因等几个核心节点在ARG-细菌共现网络中发挥了重要作用，可能成为连接细菌和ARGs的枢纽，从而促进抗性基因在微生物群落内的传播和扩散。此外，未观察到细菌多样性与ARGs丰度之间的显著相关性。这一发现与一些现有研究不同：例如，一项关于大熊猫的宏基因组研究报告了细菌多样性与ARGs丰度之间存在明显的负相关，其他研究也表明较高的细菌多样性可能通过生态位竞争抑制抗性基因的传播。这种不一致表明，细菌多样性与ARGs丰度之间的关系不是恒定的，而是受多种因素共同调节的，如环境选择压力、方法学差异和跨界生物相互作用。此外，单时间点采样可能无法捕捉多样性-抗性关系的动态特性。未来的研究应采用纵向队列设计、单菌株分辨率测序和体外肠道模型来进一步验证这一阴性结果的稳健性。
尽管有几个核心细菌属与宿主性别、年龄和特征向量中心度等因素显示出显著关联，并且某些高丰度ARGs与宿主性别、年龄和特征向量中心度相关，但未识别出与宿主性别或特征向量中心度特异性相关的细菌和ARGs之间的协调变化。相反，在宿主年龄相关的细菌和ARGs之间观察到了多个显著相关性。值得注意的是，在ARGs（包括金黄色葡萄球菌mupA和patB）与细菌属（如拟杆菌属、梭菌属和支原体属）之间识别出一个关联网络，这些细菌属本身显示出与宿主年龄相关的模式。总之，这些结果表明宿主年龄可能是调节该猴群中特定细菌属与ARGs之间相关性的重要因素。在非人灵长类动物中，拟杆菌属通常被认为是肠道健康的标志。与宿主年龄相关的饮食和生活方式变化可能促进拟杆菌属的增殖，其多样化的代谢产物和免疫调节特性可能反过来抑制携带mupA的金黄色葡萄球菌和其他携带patB的细菌的生长。这种负相关在老年个体中更为明显，表明拟杆菌属可能有助于维持老年宿主的肠道稳态并限制耐药细菌的扩张。相比之下，梭菌属以其在肠道中的多功能代谢活性而闻名，可能产生特定的营养物质或代谢物来支持金黄色葡萄球菌的生长。同时，支原体属可能促进抗性基因向其他细菌的水平转移，从而推动ARGs的传播。这些正相关在年轻藏酋猴中更为明显，表明梭菌属和支原体属可能在生命早期阶段对耐药基因的传播发挥更突出的作用。
总之，这些发现强调了宿主年龄是影响藏酋猴肠道微生物与ARGs之间协调变化的重要因素。通过调节特定核心属的丰度，宿主年龄可能与ARGs流行率的变化间接相关——这种模式可能是在长期进化过程中由宿主生理和生态因素共同作用塑造的。
结论
本研究首次对生活在黄山的藏酋猴肠道微生物组中的细菌群落和ARGs进行了深入的宏基因组分析。通过系统表征ARGs的组成，评估个体因素对ARGs多样性和高丰度基因的影响，并探索肠道微生物与ARGs之间的相互关系，这项工作揭示了该灵长类物种肠道抵抗组的复杂性及其驱动因素。结果表明，藏酋猴的肠道微生物组拥有多样化的ARGs库，以多重耐药、糖肽类和肽类抗性类型为主——这一特征不同于其他非人灵长类动物报告的图谱，表明其具有更高的多重耐药基因积累倾向。识别出的主要抗性机制是抗生素靶点改变和抗生素外排。虽然宿主年龄、性别和特征向量中心度系数没有显著影响整体ARGs多样性，但它们与几个高丰度ARGs的相对丰度显著相关。值得注意的是，社会网络中心性的影响仅限于两个ARGs（cdeA和fusA(mut)），而与年龄相关的影响则更为广泛和稳健。这些发现表明，宿主年龄是比社会网络位置更强且更普遍的ARGs图谱变异驱动因素，社会互动可能通过选择性传播或共享环境暴露在影响这些特定抗性基因丰度方面起次要作用。此外，观察到了广泛的细菌-ARGs相互作用，宿主年龄成为驱动其共变的关键因素。
这些发现阐明了野生灵长类动物肠道抵抗组的组成和驱动因素，为监测、风险评估和针对野生动物抗菌素耐药性的干预策略奠定了科学基础。未来的工作可能侧重于此处确定的具体指标：（1）宿主相关的ARG生物标志物（例如，用于宿主性别的gryB、rpoB、macB和novA；用于宿主年龄的efrA、patB、mupA和RanA；用于社会中心性的cdeA和fusA (mut)）；（2）环境暴露指标，如人类相关废物以及共享土壤和水中ARGs与可移动遗传元件的丰度；（3）宿主行为指标，特别是特征向量中心度；（4）伴随核心肠道菌群（如拟杆菌属、梭菌属、罗斯氏菌属）的变化，这些变化与抵抗组共变。对这些综合指标进行纵向追踪，将推动从描述性分析走向对抵抗组动态的机制性理解，最终支持针对野生动物抗菌素耐药性的靶向风险评估和缓解。需要在更广泛的生态梯度上进行进一步研究，以验证这些指标并阐明宿主生理、生态和抵抗组之间复杂的相互作用。
这项研究是在一个习惯长期补充投喂的猴群中进行的。尽管玉米大约占其饮食的三分之一，并且最大限度地减少了人类接触，但我们不能完全排除投喂对肠道微生物组和ARGs背景的稀释或放大效应。将这些发现外推到非投喂种群时需要谨慎。同时，由于猴群规模小以及野外工作的后勤限制，未来的研究应扩大样本量，涵盖黄山多个猴群或其他种群，以检验我们结论的普遍性。
