电场刺激作为研究线虫肌肉衰老过程中线粒体Ca2+稳态的新方法

《Methods》：Electric field stimulation in Caenorhabditis elegans as a novel approach to investigate mitochondrial Ca2+ homeostasis during in vivo muscle aging

本文推荐研究线粒体钙（[Ca2+]mito）稳态随年龄变化的实验方法局限性问题。研究人员采用秀丽隐杆线虫咽肌模型，引入电场刺激新方法以可靠、重复地触发[Ca2+]mito摄取。研究发现，基础[Ca2+]mito和电场诱导的钙瞬变均随衰老而增强，并揭示了线粒体钙过载的年龄依赖性、MCU依赖性及区域特异性模式。该研究提供了一种研究体内[Ca2+]mito动力学的有力工具，对理解年龄相关的肌肉功能障碍具有重要意义。

　　

在细胞的生命活动中，线粒体不仅是能量的工厂，还是一个关键的钙离子（Ca²⁺）调节中心。线粒体钙（[Ca²⁺]_mito）稳态对于维持细胞的信号传导、能量代谢乃至生存都至关重要。然而，这种精密的调控会随着年龄的增长而逐渐失衡。研究表明，在衰老过程中，基础[Ca²⁺]_mito水平会升高，这被认为是导致包括肌肉在内的可兴奋组织功能衰退的重要因素之一。因此，深入探究[Ca²⁺]_mito在衰老过程中的动态变化，对于理解并干预年龄相关疾病具有关键意义。

然而，在活体（in vivo）实时观测这一过程充满了挑战。传统的实验方法，例如使用药物（如咖啡因、卡巴胆碱或血清素）来刺激Ca²⁺释放，存在诸多局限。这些药理学方法依赖于药物吸收和咽部泵吸行为，而后者本身会随衰老而减弱，导致刺激效果不稳定且难以重复。更重要的是，它们通常只能提供单次刺激，无法模拟肌肉在生理状态下受到重复兴奋的实际情况，从而难以揭示[Ca²⁺]_mito在持续挑战下的摄取、缓冲和恢复能力，特别是与衰老相关的线粒体钙过载（overload）现象。

为了解决这些难题，一篇发表于《Methods》期刊的研究引入了一种创新的方法。研究人员以秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans, C. elegans）的咽部肌肉作为理想的活体研究模型，采用电场刺激（electric field stimulation）作为一种强大且可控的触发手段，来研究其在衰老过程中对[Ca²⁺]_mito动力学的调控。

为了开展此项研究，作者主要应用了以下几项关键技术方法：第一，使用表达线粒体靶向FRET（荧光共振能量转移）Ca²⁺传感器YC3.60的AQ3055线虫品系进行活体成像。第二，建立了优化的电场刺激（如10 V， 10 s）和传统的药理学刺激（如15 mM咖啡因）两种方法进行对比研究。第三，通过药物干预，如使用米托蒽醌（mitoxantrone）抑制线粒体钙单向转运体（Mitochondrial Calcium Uniporter, MCU），来探究Ca²⁺摄取的关键通路。样本来自在不同成年天数（第7、14、21天，分别代表年轻、中年和老年）收集的线虫。第四，对咽部不同区域（嗉囊和咽后球）的[Ca²⁺]_mito信号进行了区域性分析。

3.1. 电场刺激可靠地诱发线虫咽肌中的[Ca²⁺]_mito瞬变

研究人员首先证实，相比于咖啡因刺激引起的微弱且异质性高的反应，特定参数（10 V， 10 s）的电场刺激能够在年轻线虫中可靠地诱发出可重复的[Ca²⁺]_mito瞬变，且基线稳定，并伴有可见的咽部收缩。此方法的响应率超过90%，远高于咖啡因刺激。药理学抑制实验表明，电场刺激诱发的[Ca²⁺]_mito摄取主要依赖于L型Ca²⁺通道介导的胞外Ca²⁺内流，而非主要由肌质网（内质网，Endoplasmic Reticulum, ER）释放驱动。

3.2. 电场刺激揭示线虫中年龄增强的[Ca²⁺]_mito摄取

研究发现，基础[Ca²⁺]_mito水平随年龄增长而显著升高。更重要的是，咖啡因刺激未能检测到年龄相关的反应差异，而电场刺激首次诱发的[Ca²⁺]_mito瞬变幅度在老年动物（第21天）中显著大于年轻动物（第7天）。这表明电场刺激能更敏感地揭示衰老过程中[Ca²⁺]_mito摄取能力的变化。

3.3. 药理学MCU抑制减弱线虫衰老过程中电场诱发的[Ca²⁺]_mito瞬变和过载

通过重复施加电场刺激（三次脉冲），研究揭示了年龄依赖性的累积性[Ca²⁺]_mito负载和不完全恢复现象，即线粒体钙过载。在中年（第14天）和老年（第21天）线虫中，对照组动物在刺激后未能将[Ca²⁺]_mito恢复至基线水平。使用MCU抑制剂米托蒽醌处理，可以显著减轻这种累积性负载，并降低出现“过载”现象的线虫比例，特别是在老年群体中。

3.4. 线虫咽部[Ca²⁺]_mito的区域性差异

将咽部细分为嗉囊和咽后球进行分析发现，对电场刺激的响应存在区域特异性。在中年和老年线虫中，嗉囊对首次电场刺激的反应显著高于咽后球，并且嗉囊区域显示出更高的[Ca²⁺]_mito过载发生率，表明嗉囊是电场诱发[Ca²⁺]_mito摄取和过载的“热点”。MCU抑制能在两个区域均减弱重复刺激引起的反应。

文章的讨论部分归纳并强调了本研究的重要意义。首先，在方法学上，电场刺激克服了传统药理学刺激的局限，提供了可控、可重复且响应率高的体内[Ca²⁺]_mito动力学研究工具，能够更精准地量化摄取、清除和过载过程。其次，在生理意义上，研究不仅确认了基础[Ca²⁺]_mito水平随衰老升高，更重要的是揭示了衰老肌肉在受到重复生理性兴奋时，其[Ca²⁺]_mito摄取能力反而增强，并更容易出现累积性过载，这可能是导致年龄相关性肌肉功能障碍的病理生理机制之一。再者，研究明确了MCU介导的Ca²⁺内流在这一年龄增强的摄取和过载过程中的核心作用，提示MCU可能是干预年龄相关肌肉衰退的潜在靶点。最后，区域性分析发现嗉囊更易发生过载，这反映了咽部不同区域在兴奋-收缩耦联和线粒体功能上的异质性。总之，该研究建立的新方法为在体研究线粒体钙稳态及其在衰老和疾病中的作用提供了有力手段，其发现深化了对肌肉衰老过程中钙处理能力失调的理解，为开发针对性的干预策略指明了方向。