《Genes to Cells》：Senescence in Normal Human Dermal Fibroblasts Induces Heterogeneous Fibril Orientation of Type I Collagen Through Downregulation of BMP-1
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本研究揭示了成纤维细胞衰老进程中I型胶原纤维形成紊乱的核心机制。研究证实，衰老细胞的细胞倍增水平（PDL）增加会导致关键酶BMP-1（骨形态发生蛋白-1）及其增强子PCPE-1表达下调，从而阻碍I型前胶原C-端前肽（C-pp）的切割。这一关键步骤的缺陷导致前胶原分泌增加，并形成了取向紊乱、含有更多前胶原的异常胶原纤维。该发现从分子层面解释了皮肤衰老过程中胶原纤维结构失调的原因，并为针对C-pp切割酶的抗衰老靶点研究提供了新的思路。
文章内容归纳
1 引言
皮肤作为人体最大的器官，承担着抵御紫外线、环境因素和病原体的重要生理屏障功能。其真皮层由成纤维细胞等多种细胞构成，其中成纤维细胞分泌胶原蛋白以构建细胞外基质。I型胶原是主要的纤维状胶原，占体内总胶原的90%以上。随着衰老进程，真皮中I型胶原的数量和质量下降，导致皱纹增多、皮肤干燥和保湿能力降低。因此，提升衰老真皮中成纤维细胞产生I型胶原的能力至关重要。
I型胶原由两个pro-α1前胶原链和一个pro-α2前胶原链组装成三股螺旋结构，这一过程从C-端前肽（C-pp）延伸到N-端前肽（N-pp），并在伴侣蛋白HSP47的协助下于成纤维细胞内完成。前胶原形成异源三聚体后，其C-pp被前胶原C-蛋白水解酶（PCPs，包括BMP-1, mTLD, mTLL1/2）切割，而这一过程在前胶原C-蛋白水解酶增强子（PCPE）蛋白家族存在时会被高度激活。一般认为，C-pp的切割发生在细胞外，由BMP-1识别并切割I型胶原α1链的特定氨基酸序列。C-pp切割步骤对胶原纤维的形成至关重要。
衰老进程中，不仅I型胶原的量减少，其纤维的取向也出现异常。细胞衰老是衰老的标志之一，因为衰老的真皮会累积衰老的成纤维细胞。衰老的真皮成纤维细胞似乎导致了衰老真皮中胶原的减少，因为有报道称I型胶原的表达在衰老的成纤维细胞以及从老年皮肤分离的成纤维细胞中下调。然而，细胞衰老如何在分子水平上影响衰老皮肤中I型胶原的细胞外纤维形成，目前尚不清楚。本研究利用具有不同细胞倍增水平（PDL）的正常人类真皮成纤维细胞（NHDFs）组群，探讨了这一问题。
2 结果
2.1 细胞衰老导致胶原纤维取向紊乱
为了研究成纤维细胞衰老如何改变I型胶原的纤维生成，研究人员制备了具有不同PDL的NHDFs组群：早期代次（10-15 PDL）、中期代次（21-26 PDL）和晚期代次（35-41 PDL）。随着PDL增加，细胞增殖速率下降，细胞衰老标志物p16和p21表达增加，SA-β-半乳糖苷酶染色上调，细胞形态变得扁平和膨大。
通过培养各组细胞1个月并用Picro Sirius红染色发现，早期和中期PDL细胞形成了密集、红色的纤维堆积，而晚期PDL形成的纤维则更粗糙、颜色更淡。进一步的免疫染色分析（使用抗COL1A1抗体，不经细胞透化）证实，早期PDL形成的每条纤维倾向于朝向同一方向，而晚期PDL形成的纤维则不具备这种规律性。二维快速傅里叶变换（2D-FFT）功率谱分析和透射电子显微镜（TEM）分析均支持这一结论，显示晚期PDL组构建的细胞外胶原纤维的厚度和取向比早期PDL组更为异质。
2.2 可视化I型前胶原分析显示晚期PDL存在C-pp加工缺陷
利用之前发表的可视化I型前胶原（在重复结构域插入GFP标签，在C-pp插入mCherry标签，称为Gr-CC）进行分析。将Gr-CC表达载体转染入各组细胞，并通过共聚焦显微镜检测荧光信号。结果显示，早期PDL细胞在核周区域显示出因GFP与mCherry融合而产生的黄色颗粒，而在伪足处显示出绿色颗粒。相比之下，晚期PDL细胞在整个细胞（包括伪足）都显示出均匀的黄色。对伪足区域的GFP和mCherry信号强度比值分析表明，晚期PDL中C-pp的切割存在缺陷。
2.3 晚期PDL中内源性C-pp切割下调，导致形成含有前胶原的纤维
考虑到C-pp切割是胶原纤维形成的关键步骤，研究人员通过蛋白质印迹分析了各组细胞的内源性C-pp切割情况。结果显示，随着PDL进展，内源性前胶原细胞内切割的产物——C-pp片段减少，而前胶原的量未显著改变，表明C-pp切割随着细胞传代而下调。
进一步分析细胞培养上清液中的胶原发现，晚期PDL分泌的胶原减少，分泌的前胶原也减少。胶原与前胶原的比值显示，早期和中期PDL分泌了几乎等量的胶原和前胶原，而晚期PDL主要分泌前胶原。免疫荧光分析使用抗C-pp抗体发现，早期PDL构建的纤维中C-pp信号微弱，而晚期PDL的纤维中检测到大量C-pp信号，表明晚期PDL细胞构建了含有前胶原的胶原纤维。
2.4 细胞内BMP-1和PCPE-1随细胞衰老而下调
为了阐明晚期PDL中C-pp切割减少的潜在机制，研究人员检测了能够加工前胶原C-pp的PCPs（BMP-1, mTLD, mTLL1/2）的表达水平。qPCR分析显示，TLL1未改变，但BMP-1在晚期PDL中显著下调。蛋白质印迹分析证实BMP-1蛋白量在晚期PDL中减少。由于BMP-1的C-pp切割活性在PCPE-1存在时会高度增强，研究人员也检测了PCPE-1。结果发现，PCPE-1在晚期PDL中同样显著下调。蛋白质印迹分析显示，PCPE-1的前体蛋白（55 kDa）和成熟蛋白（36 kDa）均随PDL进展而下调。体外BMP-1活性检测也支持其活性随PDL进展而降低。这些结果表明，由BMP-1和/或BMP-1/PCPE-1表达减少引起的BMP-1活性下调，导致了晚期PDL中C-pp加工的减少。
2.5 在早期PDL中敲低BMP-1导致产生与晚期PDL相似的胶原纤维
为了研究晚期PDL中细胞外纤维取向异质性的原因，研究者在早期PDL细胞中进行了BMP-1敲低实验。生化分析证实，经siBMP-1处理的早期PDL细胞中，BMP-1的mRNA和蛋白均显著减少，且体外检测的BMP-1活性也显著降低。敲低BMP-1导致早期PDL细胞中切割的C-pp片段显著减少，分泌的胶原减少，并且分泌的胶原与前胶原的比值变化，显示细胞主要分泌前胶原。这表明BMP-1敲低抑制了早期PDL中的C-pp加工。
对经siBMP-1处理的早期PDL细胞进行细胞外胶原纤维免疫染色分析发现，对照组细胞形成了高度定向的纤维，而siBMP-1处理则打乱了胶原纤维的取向。2D-FFT功率谱分析证实了这一点。使用抗C-pp抗体的免疫荧光分析显示，经siBMP-1处理的早期PDL细胞C-pp信号增加。因此，BMP-1下调导致的C-pp加工减少，引起了含有前胶原且取向紊乱的胶原纤维的形成。
3 讨论
C-pp加工是细胞外空间胶原纤维形成的关键步骤。本研究首次揭示了随着成纤维细胞衰老进程，I型胶原C-pp加工及其相关PCPs的改变。可视化I型前胶原首先显示晚期PDL细胞中前胶原的细胞内C-pp切割减少。生化分析证实，C-pp切割在晚期PDL中减少，这是由于细胞内BMP-1和PCPE-1下调所致。晚期PDL细胞最终向细胞外空间分泌了比胶原更多的前胶原，导致了胶原纤维取向的异质性，并且这些纤维比早期PDL形成的纤维含有更多的前胶原。
从前胶原中移除C-pp降低了纤维形成的临界浓度，因此C-pp加工对纤维形成至关重要。然而，前胶原能够与胶原一起在细胞外空间形成稳定的纤维。在早期PDL中，分泌的胶原优先通过自组装过程形成适当的纤维，因此数量足够少的前胶原则难以掺入纤维；而在晚期PDL中，前胶原与胶原比率的增加可能导致前胶原更频繁地掺入纤维，从而导致纤维取向紊乱。
研究还探讨了BMP-1减少导致胶原纤维取向紊乱的其他可能机制。BMP-1被报道通过切割参与小亮氨酸丰富蛋白聚糖（SLRPs，如核心蛋白聚糖和双糖链蛋白聚糖）的成熟过程，而SLRPs通过与胶原单体直接相互作用来调节胶原的纤维生成。因此，晚期PDL中BMP-1活性降低可能诱导SLRPs不成熟，从而扰乱细胞外胶原纤维的取向。此外，BMP-1作为赖氨酰氧化酶（LOX）和赖氨酰氧化酶样蛋白（LOXL）的激活剂，这些酶的活性形式在胶原纤维形成的最后一步（特别是细胞外区域的交联）中发挥作用。因此，晚期PDL中BMP-1活性降低可能影响胶原纤维形成的最后步骤。本研究数据提示了与细胞衰老相关的胶原纤维改变与个体衰老之间的潜在联系。C-pp切割酶（如BMP-1）是改善与衰老相关的胶原纤维改变的潜在靶点。
