铜催化的叠氮-炔烃环加成反应结合荧光免疫分析法，通过原位生成的铜纳米颗粒检测伏马菌素B1

《Microchemical Journal》：Copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition-mediated fluorescence immunoassay for Fumonisin B1 detection via in situ generated copper nanoparticles

新型在位合成点击酶生物传感策略用于黄曲霉毒素B1的高灵敏检测，通过免疫复合物催化生成抗坏血酸还原铜离子形成DNA模板铜纳米颗粒，驱动CuAAC反应产生荧光信号，检测限达10 pg/mL，解决了预合成纳米材料成本高、稳定性差的问题。

　　

刘艳|吴丽英|兰玉婷|王玉欣|徐宁|刘水|杜娟|张红|余瑶

吉林医科大学公共卫生学院，中国吉林

摘要

尽管纳米材料在提高生物传感平台性能方面具有巨大潜力，但其广泛应用受到制造复杂、批次间差异以及储存稳定性不足等挑战的限制。在这项研究中，我们开发了一种基于原位生成的点击酶的新生物传感策略，以解决这些限制，并将其应用于有害霉菌毒素伏马菌素B1（FB1）的免疫检测。在检测过程中，免疫复合物形成后，碱性磷酸酶（ALP）催化生成抗坏血酸（AA），后者促使Cu²⁺还原，从而实现DNA模板铜纳米颗粒（CuNPs）的原位生长。作为高效的点击酶，CuNPs促进了铜催化的叠氮-炔烃环加成（CuAAC）反应，产生强烈的荧光信号。该方法表现出显著的灵敏度，检测限（LOD）低至10 pg/mL。通过避免使用预先制备的纳米材料，它为目标分析物的痕量检测提供了一个经济高效且简化的平台。该研究还为基于CuAAC的免疫检测方法的发展提供了宝贵的见解。

引言

伏马菌素是由多种Fusarium物种合成的有害次级代谢产物[1]。在已知的15种类似物中，伏马菌素B1（FB1）、FB2和FB3在自然污染的玉米中最常见，其比例约为12:4:1，其中FB1的毒性最高[2]。这些霉菌毒素可污染多种谷物和农作物，对人类和动物健康构成严重威胁[3]。它们的危害包括急性和慢性毒性效应，如食物中毒、免疫抑制和内分泌紊乱[4]、[5]。由于FB1的毒性显著，国际癌症研究机构（IARC）将其归类为2B类致癌物[6]。因此，已制定了相关监管限制，例如美国FDA指南规定农产品中FB1和FB2的总含量不得超过2 mg/kg[7]。尽管一直在努力控制污染，但FB1的出现仍然难以避免。定期检查和监测食品质量对于降低FB1的风险至关重要。目前，高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）被认为是检测FB1的金标准，因其具有高灵敏度和准确性[8]。然而，该方法依赖于复杂的仪器和专业操作人员，限制了其在大规模筛查和现场应用中的适用性。为了解决这一问题，人们开发了结合纳米材料（如金纳米颗粒（AuNPs）、MnO₂和上转换纳米颗粒（UCNPs）的免疫检测方法，以实现灵敏度和高通量检测[2]、[9]、[10]、[11]、[12]、[13]。然而，这些方法通常涉及复杂的纳米材料合成，并面临稳定性、储存和运输方面的挑战。因此，仍迫切需要开发出高灵敏度、高通量且用户友好的FB1检测方法。

在这方面，点击化学——特别是铜(I)催化的叠氮-炔烃环加成（CuAAC）——为设计稳健且模块化的检测平台提供了有前景的替代方案[14]、[15]、[16]。CuAAC反应在温和条件下进行，具有高效率和选择性，形成稳定的1,2,3-三唑连接，并已广泛应用于荧光、比色和电化学检测[17]、[18]、[19]、[20]。然而，传统的基于铜的纳米催化剂（如CuO NPs）存在催化位点可及性有限和扩散障碍的问题，通常需要外部刺激来释放铜离子，这可能影响重复性。尽管已经开发出铜纳米花、纳米酶和金属-有机框架（MOFs）等先进纳米结构以改善催化性能[21]、[22]、[23]，但其合成通常需要苛刻的条件，导致成本高昂且储存和运输复杂。因此，开发一种简单、高效且原位生成的纳米催化剂作为“点击酶”，可以克服这些限制，为基于CuAAC的FB1检测开辟新途径——实现高灵敏度、高通量且用户友好的免疫检测方法，适用于实验室和实际应用。

在这项工作中，我们构建了一种用于CuAAC点击反应的原位“点击酶”组装方法，并将其应用于免疫检测（图1）。抗原FB1-牛血清白蛋白（FB1-BSA）被固定在96孔ELISA板上。样品中的FB1与包被的FB1-BSA竞争单克隆抗体（McAbs）的结合位点。未结合的McAbs通过洗涤去除。然后引入碱性磷酸酶偶联的山羊抗小鼠IgG（ALP-IgG）与捕获的McAb-FB1-BSA复合物结合。结合的ALP催化抗坏血酸2-磷酸（AAP）转化为抗坏血酸（AA）。通过AA介导的CuSO?还原原位合成的单链DNA模板铜纳米颗粒（ssDNA-CuNPs）作为“点击酶”催化剂，驱动CuAAC“点击”反应，使荧光探针叠氮化合物1与炔烃2发生反应，生成高荧光的三唑化合物3，从而产生强烈的信号。这种原位点击酶生成策略避免了储存和运输预先合成纳米材料的高成本和稳定性问题。因此，本研究不仅为新型高效CuAAC点击酶的设计提供了原理，还展示了开发低成本点击免疫检测方法用于痕量分析物的广泛潜力。

试剂和仪器

试剂和仪器

所有化学品、试剂、仪器及其来源的详细信息见补充信息。

ALP的荧光检测

ALP活性检测包括以下步骤：将不同浓度的ALP-IgG（2500、1250、625、312.5、156.25和78.125 ng/mL）加入80 μL 160 mM AAP（在含有150 mM NaCl、pH 8.0的10 mM MOPs缓冲液中制备）中，然后在37°C下孵育30分钟。随后加入9 μL 8 mM CuSO₄和1 μL 100 μM ssDNA的混合物，并进行振荡孵育。

基于CuAAC的免疫检测的分析原理

该传感器通过ssDNA模板原位自组装的CuNPs来工作。这种设计利用了核苷酸对金属阳离子的亲和力，促进这些离子在DNA支架纳米材料中的局部还原[24]。在我们的系统中，多聚T ssDNA通过结合Cu²⁺离子引导CuNP的形成，随后Cu²⁺在模板上被AA还原为Cu⁰[25]。我们通过制备ALP、AAP、CuSO?和ssDNA的混合物来表征这种自组装过程。

结论

总之，我们开发了一种新型免疫检测方法，利用高效的点击化学反应实现信号放大，能够灵敏且特异性地检测玉米粉中的FB1。该方法利用原位自组装的DNA-CuNP点击酶，不仅驱动快速的CuAAC反应，还消除了与预先合成纳米材料相关的稳定性和处理问题。检测限为10 pg/mL，性能可与现有方法相媲美。

CRediT作者贡献声明

刘艳：撰写——初稿。 吴丽英：数据整理。 兰玉婷：实验研究。 王玉欣：验证。 徐宁：监督。 刘水：资金获取。 杜娟：正式分析。 张红：方法学设计、资金获取。 余瑶：撰写——审阅与编辑、概念构思。

利益冲突声明

作者声明没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究得到了国家大学生创新创业培训计划（S202513706013；S202513706080）；国家自然科学基金（NSFC82302563）；以及吉林省科技厅（20230203088SF）的支持。