《Microchemical Journal》：A polarity-sensitive fluorescent probe for imaging lipid droplet from cellular models to alcoholic fatty liver tissue
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miRNA-21高灵敏检测：DNA-AuNPs纳米传感器通过双信号放大机制（链置换暴露DNAzyme催化位点，释放Fc标记DNA片段）实现0.6 aM检测限和100 aM-10 nM宽线性范围，结合便捷的层积分离工艺和序列可编程设计，适用于多种癌症细胞线的精准miRNA量化分析。
Xinyi Jing|Yifan He|Jin Shao|Shan Huang|Xiaojun Chen
江苏省大学化学与分子工程学院，南京工业大学智能医疗传感材料与设备重点实验室，中国南京211816
摘要
尽管基于DNA酶的miRNA检测技术取得了显著进展，但在复杂的生物基质中实现强大的适应性、灵敏度和性能仍面临挑战。为了解决这些限制，我们开发了一种双信号放大的“DNA-AuNPs”纳米传感试剂盒，用于高灵敏度和稳定地检测miRNA-21。该系统使用Fc标记的三链DNA杂交体（RS链）和PolyA-DNA（F链）共固定在金纳米颗粒（AuNPs）上。这些DNA-AuNP探针通过生物素化的连接DNA/链霉亲和素复合物锚定在表面。当miRNA-21结合时，链位移会暴露Mg2+依赖的DNA酶切割位点。随后加入Mg2+会触发酶促切割，释放出带有Fc标签的DNA片段（P-DNA），这些片段被c-DNA修饰的Au电极捕获。由此产生的Fc电化学信号与miRNA-21浓度直接相关。利用DNA-AuNPs的双信号放大效应以及试剂盒简化的分离流程，该检测方法实现了宽广的线性范围（100?aM–10?nM）和超低的检测限（0.6?aM，信噪比=?3）。这种卓越的灵敏度使得能够在多种癌细胞系中精确定量miRNA-21。此外，该平台的序列可编程设计允许通过简单修改探针序列来适应其他miRNA，凸显了其在临床和研究应用中的多功能性。
引言
微小RNA（miRNAs）是高度保守的非编码单链RNA分子（19–22个核苷酸），在生理和发育过程中发挥着关键作用，包括细胞分裂、分化、凋亡[1]、[2]、[3]以及基因调控[4]、[5]、[6]。传统的miRNA检测方法，如Northern印迹[7]、微阵列技术[8]和实时聚合酶链反应（RT-PCR）[9]已取得显著进展，但仍存在灵敏度不足、样品制备繁琐、数据处理复杂和仪器成本高等局限性[10]、[11]、[12]。因此，迫切需要开发具有高灵敏度、准确性和快速结果的新miRNA检测平台。
近年来，荧光[13]、[14]、[15]、比色[16]、[17]、[18]、电化学发光[19]、[20]和电化学[21]等技术因其操作简便和高灵敏度[23]而成为有前景的替代方案。其中，电化学生物传感器因其与信号放大策略（如杂交链反应（HCR）[24]、[25]、[26]和催化发夹组装（CHA）[27]、[28]、[29]的兼容性而脱颖而出，能够实现高灵敏度的miRNA检测。尽管这些放大方法具有可靠性和等温可控性，但在设计复杂性和多步骤反应程序方面仍存在挑战。
DNA酶作为一种新兴的催化工具，由于其简单的设计、高灵敏度和出色的稳定性，在传感应用中得到了迅速采用。它指的是一种能够识别结构并特异性切割底物链的催化单链DNA序列，这一过程通常由氨基酸或金属离子辅因子（如Pb2+、Zn2+、Mg2+、Cu2+、UO22+和Na+）促进[30]、[31]、[32]、[33]、[34]。与传统蛋白酶和核酸酶相比，DNA酶具有更强的催化稳定性，使其成为原位临床诊断的有希望的候选者[35]、[36]、[37]。最近的发展将DNA酶与纳米材料结合，结合了它们的各自优势，实现了双信号放大，从而实现高灵敏度的miRNA检测[38]、[39]、[40]。例如，一种采用金属硫化物纳米颗粒的双条形码触发DNA酶级联策略能够同时检测miRNA-21和miRNA-141，并增强荧光输出[41]。尽管取得了这些进展，但由于纯化或分离不足，这类复合系统常常会出现信号干扰，导致背景噪声增加和灵敏度下降。为了解决这些问题，受ELISA等机制启发的分层组装策略的传感器试剂盒提供了有效的信号纯化和背景抑制。利用DNA的稳定性、可编程性和低成本，开发了几种无蛋白的传感试剂盒。例如，结合DNA适配体和纳米材料的氯霉素检测试剂盒通过荧光、电化学或比色读数实现了皮摩尔级别的检测限[42]。这些成功案例激励了开发新型miRNA检测试剂盒的开发，这些试剂盒集成了高效的信号分离、高灵敏度和低背景干扰。
在这里，我们将广泛用于传感的AuNPs（因其独特的光学性质、易于修饰和高表面积）与DNA酶结合，构建了一种称为“DNA-AuNPs”的复合探针。利用这种探针，我们开发了一种双信号放大的纳米传感试剂盒，用于高灵敏度检测miRNA-21。信号放大的原理如下：第一阶段，AuNPs介导的富集放大解决了信号分子浓度低的问题；第二阶段，DNA酶催化的增殖放大使信号强度呈指数级增加。具体来说，DNA-AuNPs的表面通过冷冻吸附[44]加载了两种类型的DNA分子。一种是5′端带有PolyA的单链DNA（F链），另一种是由连接DNA（L-DNA）、DNA酶（e链）和底物链（S链）组成的杂交三链DNA，两端分别带有铁茂（Fc）和PolyA（RS链）（图1A）。上述DNA-AuNPs复合物通过F链与固定在板上的生物素化连接DNA（Bio-L-DNA）之间的杂交引入96孔板的底部，从而构成“DNA-AuNPs”纳米传感试剂盒（图1B）。在miRNA-21存在的情况下，会发生链位移反应，释放出L-DNA，形成miRNA-21/L-DNA复合物（SD链）。因此，e链/S链杂交体（I链）导致结构恢复，e链中的金属离子结合位点被暴露。由于DNA-AuNPs固定在纳米传感试剂盒的底部，每次洗涤后纯化和分离变得方便，有效降低了背景信号。当向“DNA-AuNPs”纳米传感试剂盒中加入过量的Mg2+时，DNA酶的酶活性被激活，完成S链中rA位点的切割，释放出带有Fc修饰的P-DNA链。P-DNA可以被捕获DNA（C-DNA）修饰的电极（C-DNA-Au/ITO）捕获，产生Fc的电化学信号，作为miRNA-21检测的定量依据。更重要的是，该试剂盒能够在不同癌细胞系中区分miRNA-21的水平。
部分摘录
概述
化学和材料以及设备和表征方法在支持信息中有详细描述。合成寡核苷酸购自上海桑贡生物工程技术服务有限公司（中国）（表S1）。
通过柠檬酸钠还原法制备15?nm大小的AuNPs[45]。向96.6?mL超纯水中加入3.4?mL 1%（w/w）HAuCl4，在剧烈搅拌下加热至沸腾，然后加入10?mL 38.8?mM三钠...
通过12% PAGE验证miRNA-21的替代特异性
执行PAGE来表征DNA酶的杂交和切割过程。如图1A所示，S链、e链、L-DNA和miRNA-21分别在1–4号泳道中显示为不同的单条带。7号泳道中杂交链的迁移速度比1号和2号泳道慢，表明LR链成功杂交（a）。加入S链后，5号泳道（b）显示的条带位置比7号泳道中的LR链更高，证明...
结论
总之，我们成功设计了一种目标触发的“DNA-Au NPs”纳米传感试剂盒，具有双信号放大功能，用于高灵敏度和稳定地分析miRNA-21。所提出的DNA-AuNPs纳米传感试剂盒具有三个显著优势：（1）简便的分离和纯化策略，有效提高了探针稳定性并最小化了背景信号干扰；（2）简化了程序，包括一步构建DNA-AuNP探针和两步检测
CRediT作者贡献声明
Xinyi Jing：撰写 – 原始草稿、方法学、研究、数据分析。Yifan He：方法学、研究、数据分析。Jin Shao：软件、方法学、研究、数据分析。Shan Huang：撰写 – 审稿与编辑、可视化、验证、监督、软件、资金获取、概念化。Xiaojun Chen：撰写 – 审稿与编辑、可视化、验证、资金获取。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的财务利益或个人关系。
致谢
我们非常感谢国家自然科学基金（编号：22304080）、江苏省自然科学基金（编号：BK20230310）和江苏省高等学校自然科学基金（编号：23KJB150011）的支持。
