《Microchemical Journal》：Poly(ionic liquid)-coated membranes: Green solid-phase DNA extraction media for nucleic acid preparation applicable to point-of-care testing
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本研究合成并表征了3-辛基-1-乙烯基-1H-咪唑-3-ium溴盐离子液体，通过原位聚合涂覆于玻璃纤维微球（GM）载体，用于细菌裂解和DNA捕获，构建了适用于现场快速检测尿路感染的集成化DNA提取平台，结合LAMP扩增和Janus Green B显色，实现90分钟内完成检测。
Sreejith Sasidharan Lathikumari | Nae Yoon Lee
生物纳米技术系，加?大学，韩国京畿道城南市寿亭区城南大路1342号，邮编13120
摘要
在这项研究中，我们合成了一种基于咪唑鎓的离子液体（3-辛基-1-乙烯基-1H-咪唑-3-鎓溴化物），并通过原位聚合将其涂覆在玻璃微纤维上，用于细菌裂解和DNA捕获，以制备适用于即时检测应用的固相DNA提取介质。聚离子液体（PIL）由带有疏水烷基链的阳离子乙烯基咪唑鎓单元组成，这有助于细胞破裂和核酸吸附。释放出的DNA随后由于静电作用固定在PIL表面。通过光谱和热分析验证了该离子液体和PIL的合成，同时使用AutoDock Vina盲对接分析研究了带负电的DNA与带正电的乙烯基咪唑鎓单元之间的相互作用机制。通过测量接触角研究了PIL表面的性质，并通过细菌抑制实验评估了其抗菌性能。将机会性医院病原体粪肠球菌（E. faecium）加入人工尿液中，在65°C下保温45分钟后，扩增了与生物膜形成和毒力相关的esp基因。使用Janus Green B进行视觉检测时，颜色从蓝色变为紫色，检测阈值为102 CFU/mL。从DNA提取到比色检测的整个过程在90分钟内完成，这是一种成本低廉、快速且便携的诊断方法，可用于检测细菌感染，特别是在临床现场环境中直接支持临床决策。
引言
尿路感染（UTIs）是全球门诊和住院医疗环境中最常见的疾病之一，每年约有1.5亿人受到影响[1]。每年有超过12,000人因尿路感染死亡，其中菌血症的死亡率超过9%[2]。不合理使用抗生素治疗尿路感染显著导致了治疗失败和抗菌素耐药性的增加。虽然已知多种细菌可引起尿路感染，但最常见的包括大肠杆菌、克雷伯菌属、变形杆菌属、肠球菌属和葡萄球菌属[3]、[4]、[5]。管理尿路感染的一个关键挑战是使用诊断技术准确识别这些病原体。
为应对尿路感染的挑战，人们开发了快速可靠的诊断策略，基于核酸的方法成为传统技术的有希望的替代方案。然而，传统的核酸分离方法（如酚-氯仿提取、硅胶膜纯化和磁珠分离）通常复杂且劳动密集，通常需要熟练人员执行多个步骤，这阻碍了它们在紧凑设备中的集成[6]、[7]、[8]。此外，还使用了各种替代化学品和材料进行细胞裂解。变性盐（如胍基硫氰酸盐和胍基氯化物）可以破坏细胞膜并使蛋白质变性[9]、[10]。同样，十二烷基硫酸钠和溴化鲸蜡基三甲基铵等洗涤剂也被广泛用于裂解细胞并溶解细胞膜成分，从而有助于高效提取脱氧核糖核酸（DNA）。
离子液体（ILs）和聚离子液体（PILs）等替代品因其作为一步细胞裂解和DNA释放平台的潜力而受到关注[11]、[12]。亲水、疏水和磁性ILs已被用于DNA提取。ILs的有效性源于其物理化学性质，特别是阳离子，它们与细胞膜中的带负电磷脂基团发生静电相互作用，破坏脂质双层。IL阳离子的疏水烷基链可以穿透脂质膜，破坏其结构完整性。IL阳离子与DNA的带负电磷酸骨架发生静电相互作用，而特定的ILs可以形成氢键稳定DNA[13]、[14]、[15]、[16]、[17]。使用功能化ILs的研究表明，与传统方法相比，提取效率更高，处理时间更短[18]、[19]、[20]。基于咪唑鎓的ILs具有高电荷密度和可调的疏水性，增强了它们进入脂质双层和破坏细胞膜以释放DNA的能力。这些ILs通过破坏微生物膜和抑制细菌活力表现出抗菌活性，使其成为DNA提取应用的强大候选者[15]、[21]、[22]。扩增技术在分子诊断中至关重要，能够快速检测病原体的DNA和核糖核酸。各种扩增方法为临床和现场应用提供了独特的优势。环介导等温扩增（LAMP）在2019冠状病毒病大流行期间得到了广泛应用[23]。LAMP操作简单、反应速度快，适用于现场诊断[24]、[25]、[26]。它使用四到六个引物识别多个目标位点，具有出色的灵敏度、特异性、较短的反应时间和相对较低的操作温度，相比聚合酶链反应更具优势。当与高效的DNA提取系统结合时，LAMP可以集成到低成本的即时检测（POCT）设备中[27]、[28]。
在这项研究中，我们合成并表征了一种基于咪唑鎓的IL（3-辛基-1-乙烯基-1H-咪唑-3-鎓溴化物），并将其用于原位聚合在玻璃微纤维（GM）滤纸上，用于基于旋柱的DNA提取试剂盒。PIL涂层的GM的疏水烷基尾部促进了细菌细胞膜的破裂，而阳离子咪唑鎓基团增强了与DNA磷酸基团的静电结合，从而促进了高效的裂解和DNA提取[29]、[30]、[31]。据我们所知，此前没有研究报告使用PIL涂层GM表面进行细胞裂解和DNA提取的研究。在这里，我们开发了一种新型的PIL涂层GM系统，用于细菌细胞裂解和DNA吸附，并将其集成到基于旋柱的DNA提取平台中，通过LAMP实现病原体DNA的有效扩增，用于即时检测传染病。为了便于视觉检测LAMP扩增产物，使用了Janus Green B（JGB）与双链DNA的小沟结合，导致颜色从蓝色变为紫色。这种视觉提示便于快速清晰地解释结果，无需额外的仪器[32]。开发的PIL涂层GM集成DNA提取试剂盒为细菌细胞裂解和DNA分离提供了快速、低成本且用户友好的平台，适用于包括检测尿路感染病原体在内的广泛应用。该提取平台有助于准确识别病原体，在基于DNA的传染病、遗传疾病和病毒学诊断中具有显著的应用潜力。
材料
以下试剂从商业供应商处购买，无需额外纯化即可使用。1-乙烯基咪唑（99%）和1-溴辛烷（99%）购自Sigma-Aldrich（美国圣路易斯）。乙酸乙酯（99%）购自Duksan Pure Chemicals（韩国安山）。GM购自CHMLAB Group（西班牙巴塞罗那）。WarmStart LAMP 2×混合液购自New England Biolabs（美国伊普斯威奇）。氢氧化钠（NaOH，≥99%）购自Daejung Chemicals
FT-IR和NMR分析
图S2a显示了1-乙烯基咪唑、1-溴辛烷和合成IL单体的FT-IR光谱。在季铵化反应后，产物显示出特征性的咪唑鎓C-H弯曲和摆动振动（595.8和654.7 cm?1），以及C-C骨架振动（916.9和959.4 cm?1）和C-C伸缩振动（1169.6 cm?1）。在1651.7 cm?1处观察到一个明显的C-C伸缩带（图S2a）。565.0 cm?1处的C-Br带消失，同时出现了
结论
本研究开发了一种PIL涂层GM集成旋柱系统，用于从粪肠球菌中提取固相DNA。提取过程包括细胞裂解、DNA纯化和吸附、DNA等温扩增以及视觉检测，提供了一种快速、低成本且紧凑的细菌分析方法，特别是在尿路感染方面。通过1-乙烯基咪唑和1-溴辛烷的季铵化反应合成的单体IL与GM结合使用
CRediT作者贡献声明
Sreejith Sasidharan Lathikumari：撰写——原始草稿、可视化、验证、方法学、研究、概念化。Nae Yoon Lee：撰写——审阅与编辑、可视化、验证、监督、项目管理、方法学、资金获取、概念化。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本工作得到了韩国国家研究基金会（NRF）（由韩国政府（MSIT）资助，项目编号：RS-2023-00208684）的支持，同时也得到了韩国国家研究基金会（NRF）通过教育部资助的基础科学研究计划（项目编号：RS-2021-NR060117）的支持。此外，本工作还得到了加?大学2024年研究基金（项目编号：GCU-202406380001）的支持。
