《Microchemical Journal》：Quantification of major royal jelly protein variants and concurrent fraud identification to confirm royal jelly quality employing the native LC-SEC-UV methodology
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主要皇家蜂胶蛋白的液相色谱-SEC-UV联用新方法及其在蜂王浆掺假检测中的应用。通过FPLC纯化并LC-HRMS注释MRJP-1至-3，建立原位检测体系，可定量分析单体与聚合体蛋白（6.0-47.0 mg/g），揭示传统蛋白检测法（BCA/Bradford/Kjeldahl）因还原干扰、假阳性等问题无法检测的蛋白构象变化，并有效识别蛋奶蛋白掺假。该方法为蜂王浆质量控制和掺假溯源提供新范式。
作者：?smail Emir Aky?ld?z、Sinem Raday、Sezer Acar、?zlem Cengiz、Emel Damarl?
研究机构：Balparmak R&D Center、Alt?parmak Food Industry and Trade Inc.（土耳其伊斯坦布尔）
摘要
传统的蛋白质检测方法和10-羟基-2-癸烯酸（10-HDA）分析方法在评估蜂王浆（RJ）的新鲜度和真实性方面效率较低。由于储存条件的影响，主要蜂王浆蛋白（MRJPs）的结构完整性及其活性可能会发生改变。常规的蛋白质检测方法无法识别MRJPs的聚集或降解情况，也无法检测出蜂王浆的掺假行为。本文介绍了一种多功能方法，通过测量各MRJPs的浓度来同时计算总蛋白质含量并检测掺假成分。研究人员提取了蜂王浆的蛋白质组，并利用高效液相色谱-尺寸排阻色谱-紫外检测（LC-SEC-UV）技术对其进行了纯化。纯度通过SDS-PAGE验证，蛋白质结构通过LC-HRMS底向上蛋白质组学分析进行解析。经过验证的MRJPs被用于开发并校准LC-SEC-UV分析方法。最终建立的检测方案被应用于实际样品分析（样品数量n=14），并用于检测掺假情况。Bradford、BCA、Kjeldahl和10-HDA检测方法的结果进一步证明了LC-SEC-UV方法的优越性。在实验样品中（n=6），MRJP-2和MRJP-3的含量分别为19.2–25.0 mg/g和11.0–21.0 mg/g；单体MRJP-1的含量为6.0–9.0 mg/g，而MRJP-1寡聚体的含量为35.0–47.0 mg/g。LC-SEC-UV方法能够检测出老化样品中的蛋白质变化，而BCA、Bradford和Kjeldahl方法则未能发现这种变化。新型LC-SEC-UV方法更准确地反映了蜂王浆的质量，将其应用于质量控制流程可确保蜂王浆产品的食品安全。
引言
蜂王浆（RJ）是由工蜂的咽下腺和上颚腺分泌的一种独特产物，是蜂王的唯一食物来源。它对幼虫的发育轨迹起着关键作用，决定其最终成为蜂王或工蜂的潜力[1]。蜂王浆的主要成分包括水（50–70%）、蛋白质（9–18%）、碳水化合物（7–18%）、脂质（3–8%）和其他生物活性分子[2][3]。其中，主要蜂王浆蛋白（MRJPs）占总蛋白质含量的80%以上。Apis mellifera的基因组通过单拷贝蛋白的基因复制编码了这些蛋白质，它们是一类具有高度同源性（60–70%）但相对含量存在显著差异的多态性糖蛋白[4][5]。目前，研究人员对MRJP-1至MRJP-5的关注尤为集中。Apalbumin-1（又称royalactin）是一种弱酸性糖蛋白，可单独存在（约48.8–60 kDa）或以寡聚体形式存在（约280、290、350、420、450 kDa）[6][7]；其中寡聚体形式占蜂王浆中水溶性蛋白质的45%[9][10][11]。这种寡聚体由MRJP-1与24-甲基胆固醇及apisimin（一种富含丝氨酸和缬氨酸的约5.5 kDa结合肽）聚合形成[12][13]。另一种主要蛋白质MRJP-2是一种弱碱性糖蛋白，分子量为约46.5–60 kDa，占蜂王浆总蛋白质的16%[11][14]。MRJP-3的分子量约为60–70 kDa，也是一种弱碱性糖蛋白，约占蜂王浆总蛋白质的26%[15]。
目前，MRJP家族和10-羟基-2-癸烯酸（10-HDA）被认为是赋予蜂王浆强营养价值和健康促进作用的活性成分。研究表明，蜂王浆蛋白具有抗菌、免疫调节、降胆固醇、促进细胞增殖和抑制细胞因子分泌等功效[1][6][17][18]。蜂王浆的新鲜度、成分和真实性是其质量的决定性因素。蜂王浆中含有多种易变分子，其中MRJPs最为敏感，因此可作为质量指标。不当储存条件或保质期延长会迅速改变这些蛋白质的结构和活性。先前的研究显示，储存温度（-20°C至50°C）会显著影响蜂王浆的成分和功能[19][20]。在室温下储存会加速Maillard反应导致的蛋白质糖基化，增加粘度和酸度，并促进蛋白质降解。蜂王浆在高温下会变色（变褐），表明在不适宜的温度下长期储存会导致品质下降。例如，一种名为MRJP-1的57 kDa蛋白质在40°C下储存30天后会完全消失[21]。MRJP-1单体、MRJP-2和MRJP-3寡聚体的稳定性受储存温度影响，最佳储存条件分别为-20°C和4°C[22]。冻干过程能去除水分，抑制Maillard反应，从而延长蜂王浆产品的储存期。
此外，在大规模生产蜂王浆的过程中可能会出现掺假现象，手段包括稀释产品或添加非蜂王浆来源的蛋白质或其他非必需成分[23][24]。因此，通过分析各MRJPs的原始形式来测定蜂王浆的总蛋白质含量非常重要。传统上，总蛋白质含量通过Kjeldahl和Dumas法测定总氮含量，或使用比色法（如BCA、Lowry、Biuret或Bradford法）进行测定[25]。然而，这些方法的特异性较低，可能导致蜂王浆蛋白质含量的检测结果出现假阳性或假阴性。它们无法区分MRJPs是否处于原始活性状态、是否发生聚集或变性，也无法反映蜂王浆的生物功能多样性和新鲜度。此外，这些方法无法检测出蛋清、奶粉或三聚氰胺等外来蛋白质添加物的存在。
虽然10-HDA是蜂王浆特有的成分[26]，常被用作质量指标，但它对高温具有稳定性，且其含量与储存时间无关[20][27]。此外，10-HDA也可以人工合成并添加到蜂王浆产品中，因此不宜将其作为质量评估的标志物[3][27][28]。因此，亟需开发一种用户友好且可靠的蜂王浆质量评估方法。本研究旨在通过测量各MRJPs的原始形式及其浓度，同时检测可能用于掺假的物质，从而更准确地评估蜂王浆的真实性、生物活性和新鲜度。目前尚无公开的方法可用于检测蜂王浆中的掺假成分及各MRJPs的含量。
本研究旨在开发一种简便准确的分析方法，通过测量各MRJPs的原始形式及其浓度来计算总蛋白质含量，并同时检测可能用于掺假的物质。我们采用高效液相色谱-尺寸排阻色谱-紫外检测（LC-SEC-UV）技术实现了这一目标。首先通过制备级离子交换（IEX）色谱和尺寸排阻色谱（SEC）纯化了MRJP-1寡聚体、单体、MRJP-2和MRJP-3，随后通过SDS-PAGE和LC-HRMS进行蛋白质组学分析。纯化的MRJPs被用于方法开发和绝对定量。实际样品分析（包括市售产品、老化样品和掺假样品）验证了该方法的准确性和有效性。同时，还应用了传统蛋白质检测方法和10-HDA分析来评估LC-SEC-UV方法的性能。
化学试剂
所用试剂包括：一水合磷酸钠（NaH?PO?）、二水合磷酸钠（Na?HPO?）、氯化钠（NaCl）、氯化钾（KCl）、一水合磷酸钾（KH?PO?）、碳酸氢铵（NH?HCO?）、三聚氰胺（≥99%）、海藻糖二水合物、牛甲状腺素（≥90%）、10-HDA（≥98%）和牛血清白蛋白（BSA粉末，≥99%），均购自Sigma Aldrich?（美国密苏里州圣路易斯）。此外还使用了无水柠檬酸（≥99.5%）、浓硫酸（H?SO?，95.0–97.0%）和铜。
结果与讨论
在开发基于蛋白质的定量方法时，首先需要获得参考蛋白以建立校准曲线。在没有分析标准品的情况下，天然来源、重组技术或化学合成是获取参考生物分子的替代途径。蜂王浆是分离纯MRJPs的良好来源。从蜂王浆中纯化MRJPs并将其用作校准物有助于提高检测的准确性。
结论
蜂王浆在蜜蜂群体中具有重要作用，正确使用的蜂王浆对人类健康有多种益处。主要蜂王浆蛋白属于不稳定的生物分子，对储存条件极为敏感，因此是评估其质量的理想指标。本研究提倡通过定量监测MRJPs的状态来克服蜂王浆质量评估的难题。我们成功开发了相关方法。
作者贡献声明
?smail Emir Aky?ld?z：负责撰写、审稿与编辑、方法设计、实验实施和概念构建。
Sinem Raday：负责初稿撰写、方法设计及实验实施。
Sezer Acar：负责数据验证、资源协调及数据分析。
?zlem Cengiz：负责数据可视化及数据分析。
Emel Damarl?：负责项目管理和组织工作。
资助情况
本研究未获得任何公共部门、商业机构或非营利组织的资助。
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文研究的利益冲突或个人关系。
致谢
作者感谢Balparmak R&D Center（土耳其伊斯坦布尔）的专家们以及董事会成员为研究提供的支持。
