《Molecular & Cellular Proteomics》：Spatial Profiling of Glycosaminoglycans (GAGomics) from Laser Microdissected Mouse Brain
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本研究旨在解决肝素硫酸盐(HS)和硫酸软骨素(CS)因结构复杂、异构体众多，在空间组织水平上分析受限的难题。为此，研究人员开发了一种结合激光显微切割(LMD)、亲水相互作用色谱(HILIC)和循环离子淌度质谱(cIM-MS)的整合工作流程，成功实现了对微量、空间分辨的小鼠脑组织切片中HS和CS二糖的鉴定与定量。该工作揭示了GAGs在组织中的空间分布特征，为生物标志物发现和糖胺聚糖组学(GAGomics)研究提供了有力的分析工具。
在我们的身体里，尤其是在大脑这样的复杂器官中，存在着一种名为糖胺聚糖(GAGs)的长链多糖分子，它们是细胞信号传导、组织稳态和疾病进展的关键调节者。其中，肝素硫酸盐(HS)和硫酸软骨素(CS)是两类高度硫酸化的GAGs，以其惊人的结构多样性和功能异质性著称。然而，正是这种复杂性——包括硫酸化位置各异、存在同分异构体和差向异构体——使得对它们的精细结构分析长期局限于“一锅烩”式的整体组织分析。传统的“批量”分析方法将组织匀浆，虽然能获得分子的平均信息，却完全抹去了分子在组织中原本的位置信息。在生命活动中，细胞的功能与其所处的微环境密不可分，分子的空间分布图谱对于理解生理和病理过程至关重要。因此，如何突破技术瓶颈，实现对复杂组织中HS和CS的高分辨率、空间定位分析，成为了糖生物学和空间组学领域一个亟待解决的问题。
针对这一挑战，来自波士顿大学的研究人员Elias Mernie和Joseph Zaia在《Molecular & Cellular Proteomics》上发表了一项创新性研究。他们成功开发并验证了一个整合的工作流程，首次实现了对小鼠脑组织中HS和CS的空间分辨、高精度分析。这项研究不仅为探索GAGs在神经系统中扮演的精细角色打开了新窗口，也为相关疾病的生物标志物发现和靶向治疗研究提供了强大的技术平台。
为开展此项研究，作者运用了几个关键的技术方法：首先，利用激光显微切割(LMD)技术，从冷冻的小鼠脑组织切片上精确切割并收集了直径从2毫米到0.125毫米不等的特定组织区域。随后，对同一份微量样品依次使用软骨素酶ABC(ChABC)和肝素裂合酶I、II、III混合酶进行顺序酶解，分别释放CS和HS的二糖单元。接着，采用亲水相互作用色谱(HILIC)对酶解产物进行基于组成和亲水性的分离。最后，利用循环离子淌度质谱(cIM-MS)对HILIC未能完全分离的异构体进行进一步区分，并基于已知二糖标准品建立的标准曲线对检测到的二糖进行定量分析。
HS和CS二糖谱分析
研究人员首先对LMD获取的小鼠脑组织进行了HS和CS的连续酶解和HILIC-cIM-MS分析。对于HS，他们在样品中鉴定出了六种主要的二糖，包括非硫酸化的ΔUA-GlcNAc(D0A0)、单硫酸化的ΔUA-GlcNAc6S/ΔUA2S-GlcNAc(D0A6/D2A0)、双硫酸化的ΔUA2S-GlcNAc6S(D2A6)，以及对应的N-硫酸化(GlcNS)系列二糖。HILIC色谱能根据硫酸化程度和N-乙酰化/N-硫酸化差异分离这些二糖，但无法区分位置异构体。然而，随后的多通道cIM分离成功基线分离了D2A0和D0A6这对异构体，并部分分离了D0S6和D2S0。同样，对于CS，研究人员鉴定出了四种不同硫酸化程度的二糖，从非硫酸化(D0a0)到三硫酸化(D2a10)。cIM分析进一步将单硫酸化的CS二糖异构体(D0a4, D0a6, D2a0)分离为三个峰，并将双硫酸化异构体(D2a4/D2a6/D0a10)分离为两个峰。这些结果证明了cIM-MS在解析HILIC无法分辨的硫酸化位置异构体方面的强大能力。
肝素硫酸盐饱和二糖及裂合酶抗性四糖分析
除了常见的不饱和二糖，得益于该工作流程的高灵敏度，研究人员还在较大组织样本(2毫米直径)中检测到了罕见的、含有饱和糖醛酸(UA)残基的HS二糖。这些饱和二糖比相应的不饱和二糖在质量上多18 amu，并且其中的异构体也能被cIM分离。此外，研究还检测到了三种推测为裂合酶抗性的3-O-硫酸化HS四糖。这些四糖由于还原端存在3-O-硫酸化葡萄糖胺(GlcN3S)而能抵抗裂合酶的完全消化。HILIC-cIM-MS分析显示这些四糖存在多种异构体形式，为深入研究HS链中特定的3-O-硫酸化功能域提供了信息。
组织体积对HS和CS二糖谱分析的影响评估
为了评估该方法的空间分辨率潜力，研究人员系统分析了不同大小(直径2毫米至0.125毫米)的显微切割组织碎片中HS和CS二糖的检测情况。结果显示，六种主要HS二糖和四种CS二糖在所有组织尺寸中均被检测到，但其丰度随组织尺寸变化。值得注意的是，二糖丰度并不总是与组织体积成正比。在0.5毫米直径的组织样本中检测到了最高的二糖丰度，增大或减小组织尺寸都未导致丰度相应增加。这表明，在较大的组织碎片中，可能有一部分GAG链由于空间位阻等原因未能被酶充分接触和解解。最重要的是，即使在最小的组织碎片(直径0.125毫米，体积约1.2 × 105μm3，约相当于120个细胞)中，依然能够检测到主要的HS和CS二糖，证明了该方法应用于极高空间分辨率分析的潜力。
肝素和硫酸软骨素二糖的定量
研究人员利用HS和CS二糖标准品建立的线性标准曲线，对0.5毫米直径组织切片中的二糖进行了绝对定量。所有标准曲线的相关系数(R2)均大于0.995，表明定量方法可靠。定量结果显示，HS二糖的浓度在23.11 ± 6.06 到 47.53 ± 14.08 pmol/μL之间，而CS二糖的浓度在4.06 ± 1.11 到 14.35 ± 1.38 pmol/μL之间。这证实了LMD-HILIC-cIM-MS工作流程对空间分辨、小规模组织样本中GAGs进行定量分析的灵敏度和稳健性。
研究结论与意义
本研究成功开发了一套整合激光显微切割(LMD)、亲水相互作用色谱(HILIC)和循环离子淌度质谱(cIM-MS)的完整工作流程，用于空间分辨的糖胺聚糖组学(GAGomics)分析。该方法的优势在于：1. 高空间分辨率：能够从微小至0.125毫米直径(约120个细胞)的组织区域中分析GAGs。2. 高结构分辨率：结合HILIC和cIM，能够有效分离和鉴定HS和CS复杂混合物中的硫酸化位置异构体。3. 高灵敏度与定量能力：不仅能检测常见的二糖，还能发现罕见的饱和二糖和裂合酶抗性四糖，并实现绝对定量。4. 同步分析：可从同一样本中顺序酶解并分析HS和CS两种重要的GAG类别。
这项工作标志着GAGs分析从“整体组织”水平迈向了“空间定位”水平的新阶段。所建立的LMD-HILIC-cIM-MS流程为在发育、神经科学、癌症和退行性疾病等研究中，深入探索GAGs的结构异质性、空间分布与其生物学功能之间的关联提供了强大的技术手段。它有望推动基于特定GAG结构域的生物标志物发现，并促进靶向GAG-蛋白质相互作用的治疗策略开发。总之，这项研究为在复杂生命系统中解密糖胺聚糖的“空间密码”铺平了道路。
