《Molecular & Cellular Proteomics》：Deciphering the Protein Phosphorylation Dynamics Triggered by Seconds of Force Stimulation
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本研究针对植物如何感知和转导重力信号这一关键科学问题，探讨了不同类型力学刺激（倒置与重力刺激）下蛋白质磷酸化的早期动态变化。研究人员利用SILIA（稳定同位素标记）定量磷酸化蛋白质组学技术，结合遗传学与免疫印迹验证，系统鉴定了与早期重力信号感知和转导相关的特异性磷酸化蛋白及位点，并揭示了整合素样蛋白GREPH1在重力向性中的关键调控作用。该工作揭示了植物区分不同机械力刺激（如重力、触摸、风）的分子基础，为理解植物响应环境的快速信号机制提供了新见解。
植物并非被动地承受环境压力，它们具备精密的感觉系统来感知光线、触摸、水分乃至重力的方向，并通过调整生长姿态来优化自身的生存策略。其中，重力向性是一种使根部向下（正向）而茎部向上（负向）生长的关键机制，对于植物在陆地上的成功定居至关重要。这一过程涉及复杂的信号级联：从重力信号的感知开始，经由生化信号转换、信号转导，最终导致器官的不对称生长。然而，在最初的几秒到几十秒内，不同类型的机械力（如单纯的倒置带来的离心力与持续的重力刺激）如何被植物区分，并触发特异的早期分子响应，仍是悬而未决的核心谜题。传统的淀粉-平衡石模型虽然被广泛接受，但膜张力假说等替代理论的存在以及钙离子信号的复杂动态，暗示着植物重力感知可能存在多元化的早期机制。蛋白质磷酸化作为最普遍的翻译后修饰之一，是细胞响应发育和环境信号的关键开关，其动态变化能在信号诱导的数秒内发生。因此，捕捉并解析重力刺激最初几十秒内的磷酸化蛋白质组学景观，对于解开重力信号通路的“启动密码”具有决定性意义。
为了深入研究早期重力信号转导，研究人员采用了稳定同位素标记拟南芥的定量磷酸化蛋白质组学方法，该方法包括四个核心步骤：1）通过15N和14N对植物蛋白进行体内化学标记；2）色谱富集磷酸化肽段并进行液相色谱-串联质谱分析；3）对质谱数据进行计算识别、定量及全面的生物信息学分析；4）利用分子生物学和分子遗传学方法验证磷酸化蛋白质组学结果。研究设计了两种互补的力学刺激实验：一种是“倒置”处理（20秒内多次180度翻转），旨在捕捉可能由离心力等因素引发的“初始钙密码”相关的磷酸化事件；另一种是“重力刺激”处理（20秒翻转后维持倒置30秒），旨在分离出与“次级钙密码”更相关的特异性磷酸化响应。通过氯化铯密度梯度离心分离胞质和膜蛋白组分，增强了膜结合磷酸化蛋白的富集。
1. 实验设计与力刺激特异性磷酸化蛋白质组学
为了区分倒转力（离心力）与纯重力对磷酸化蛋白质组的影响，研究设计了两种互补的定量磷酸化蛋白质组学实验：20秒连续倒置和30秒重力刺激（即倒置后保持）。通过氯化铯密度梯度离心分离胞质和膜蛋白，对来自拟南芥地上器官的样品进行了深入的LC-MS/MS分析。最终在倒置和重力刺激实验中分别鉴定出2,733和2,878个磷酸化蛋白，定量分析则分别识别出34个和52个被显著调控的磷酸化蛋白组。
2. 定量与功能磷酸化蛋白质组学解码力刺激特异性磷酸化蛋白的细胞功能
功能分析显示，倒置特异性磷酸化蛋白与响应镉/锌离子等过程相关，而重力刺激特异性磷酸化蛋白则显著富集于钙信号传导/稳态（如ACA8, ZAC, IQD2, ANNAT1）、膜囊泡运输（如ABCG36/C14, ARF-GAP8）和脂质信号（如PIP5K8/9）等功能主题。通过Volvox图表对相互作用网络和功能簇进行可视化分析，进一步明确了这些蛋白质在响应不同类型机械力中的特异性角色。
3. 茎部富集的磷酸化特征驱动拟南芥重力向性中的力特异性信号
研究筛选并验证了三个关键的力刺激响应磷酸化位点：PATL3-S108、TREPH2-S107和ATEH2-S1145。免疫印迹分析证实，这三个位点在单次倒置（重力刺激）后均能快速发生磷酸化增强，且这种增强在茎部组织中尤为显著，峰值出现在刺激后5分钟。更重要的是，这些磷酸化位点对不同类型的机械力（重力、触摸、风）表现出差异化的响应模式：pS108-PATL3对重力刺激的响应最为强烈，而pS107-TREPH2和pS1145-ATEH2则对触摸和风刺激更敏感。这为植物区分不同机械力提供了潜在的分子标记。
4. GREPH1在茎重力向性和力相关蛋白磷酸化中的调控作用
通过CRISPR/Cas9敲除筛选，研究鉴定出一个关键调控因子——整合素样蛋白GREPH1（Gravity Regulated Phosphoprotein 1）。对 greph1突变体的功能验证表明，其花序茎在重力刺激下的弯曲程度显著降低，存在重力向性缺陷。此外，在 greph1突变体中，pS107-TREPH2和pS1145-ATEH2这两个位点的过度磷酸化现象在刺激后20-50秒达到顶峰，而在野生型植物中，这种过度磷酸化则能持续更长时间（20秒至2小时）。这表明GREPH1不仅调节某些磷酸化蛋白的时空动态，还参与调控茎的重力弯曲反应，其功能类似于沉降质体的感受器。
本研究系统解析了植物在秒级机械力刺激下（倒置与重力刺激）的早期磷酸化蛋白质组动态，成功绘制了与重力信号感知和转导相关的特异性磷酸化图谱。研究发现，倒置（初始钙密码）触发的磷酸化蛋白可能通过EF-hand蛋白感知钙信号、经CPK1转导并由钙调蛋白相互作用蛋白介导，最终可能与由受体样激酶启动、通过RAF15和MKK1/2激酶介导的MAPK级联通路交汇，共同诱导重力向性反应。而重力刺激（次级钙密码）特异的磷酸化蛋白则在钙信号/稳态、膜囊泡运输和脂质信号传导中发挥作用，支持PIN蛋白/生长素分子的运输以及生长素/应激信号转导。研究不仅鉴定出PATL3、TREPH2和ATEH2作为区分不同力学刺激的特异性磷酸化生物标志物，更重要的是揭示了整合素样蛋白GREPH1作为一个新的早期力感知和信号转导组件，通过调节关键磷酸化位点的时空动态来调控茎的重力弯曲。这项工作建立了一套茎部富集的独特磷酸化“指纹”用于区分重力信号，为理解植物如何解码复杂的机械力环境并启动适应性生长提供了全新的分子框架，也为未来作物抗逆性改良提供了潜在的靶点。
