桑A（SanA）在E. coli细胞壁完整性中的作用：一种通过与PBP1B功能互作调控肽聚糖合成的新型调节因子

《Molecular Microbiology》：SanA Plays a Role in Peptidoglycan Integrity in Escherichia coli

本文重点探讨了大肠杆菌中一个名为桑A（SanA）的新型膜蛋白如何调控细胞壁的完整性。研究发现，在RodZ功能受损导致肽聚糖合成缺陷的细菌中，桑A的失活突变能作为抑制因子，部分恢复其生长。机制上，桑A与关键的肽聚糖合成酶PBP1B相互作用，负向调控其活性。这为理解细菌如何精细平衡肽聚糖的合成与修复以维持细胞形态和耐药性（如对万古霉素的敏感性）提供了新见解。研究揭示了桑A-PBP1B轴是维持细胞壁稳态的一个潜在调控节点。

　　

1 引言

细菌的生存和形态维持依赖于其细胞壁的主要成分——肽聚糖。肽聚糖的合成与降解需精确调控，受损部分必须被持续修复。在大肠杆菌中，负责细胞伸长的肽聚糖主要由Rod复合体合成。RodZ是该复合体的非必需组分，但其功能失调会导致肽聚糖合成异常、细胞形态缺陷和生长受损。

先前的研究从RodZ功能受损的细胞中分离出多个能恢复生长的抑制突变株。大部分突变位于Rod复合体的其他组分中。然而，其中一个抑制突变发生在之前与Rod复合体无关的基因sanA上，即sanA^M27R，这是一个功能丧失型等位基因。桑A被预测为一个跨膜蛋白。早期研究表明，桑A的过表达能抑制对万古霉素敏感的菌株，而缺失sanA的细胞在43°C下会对万古霉素敏感，但其分子机制及是否影响膜通透性存在争议。近期另有研究指出桑A是肽聚糖合成的新型负调控因子。本研究旨在探究桑A与肽聚糖合成及修复关键酶PBP1B之间的关系，阐明其在维持肽聚糖完整性中的作用。

2 结果与讨论

2.1 sanA突变体的分离与初步表征

研究团队从一个RodZ跨膜区被MalF跨膜区替换的嵌合蛋白（称为RMR）菌株中，分离到一个生长抑制突变株，其携带sanA^M27R突变。该突变位于桑A蛋白跨膜区与周质区的边界（Met27）。与之前Rod复合体组分的抑制突变（如MreB^A125V）能完全恢复RMR细胞的生长和杆状形态不同，sanA^M27R仅能部分恢复RMR细胞的生长速率，并使其细胞宽度变窄，但未能纠正其异常的细胞长度和形态，也无法恢复Rod复合体的形成。这表明桑A^M27R的抑制机制与直接增强Rod复合体活性的突变不同。

进一步的实验证实，sanA^M27R和sanA缺失都能部分抑制rodZ缺失菌株的生长缺陷。表型分析显示，桑A缺失细胞（sanA^M27R或?sanA）对美西林（靶向PBP2）的敏感性与野生型相当，但对氨曲南（靶向PBP3）表现出轻微的耐药性增强。重要的是，桑A^M27R和?sanA细胞都对万古霉素更敏感，且免疫印迹显示桑A^M27R蛋白稳定性与野生型相当，表明M27R突变导致的是功能丧失，而非蛋白不稳定。膜通透性实验表明，?sanA细胞与野生型细胞无显著差异，提示其万古霉素敏感性可能并非源于外膜通透性的简单改变。

2.2 桑A功能与PBP1B/LpoB相关

为了探究桑A是否通过影响肽聚糖合成相关蛋白来发挥作用，研究构建了桑A与两类主要A类青霉素结合蛋白（PBP1A和PBP1B）及其各自激活因子LpoA和LpoB的双缺失突变体，并测试了它们对万古霉素的敏感性。

结果表明，?mrcA（PBP1A缺失）和?sanA在万古霉素敏感性上表现出叠加效应。相反，?mrcB（PBP1B缺失）细胞对万古霉素的抵抗力强于野生型，而?mrcB?sanA双缺失细胞的耐药性甚至比?mrcB更强。同样，?lpoB（PBP1B激活因子缺失）与?lpoA（PBP1A激活因子缺失）的表型分别与?mrcB和?mrcA相似。这些遗传互作数据暗示，桑A的功能与PBP1B/LpoB通路的关系更为密切。

2.3 桑A与PBP1B的相互作用

研究通过细菌双杂交（BACTH）试验和免疫共沉淀（Co-IP）验证了桑A与PBP1B之间的物理相互作用。BACTH试验显示桑A与PBP1B有微弱的相互作用信号，但与PBP1A、RodZ或RMR无相互作用。进一步的Co-IP实验则提供了更直接的证据：当使用抗FLAG抗体沉淀FLAG标记的PBP1B周质域片段时，桑A-His₆在洗脱液中被特异性富集，表明两者在体内能够发生关联。尽管不能完全排除其他蛋白介导的间接作用，但这一结果为桑A通过PBP1B发挥作用提供了生化基础。

2.4 桑A在E. coli中的生物学意义及其过表达效应

在正常条件下，?sanA细胞的形态和生长速率与野生型相似。然而，当桑A被大量过表达时，野生型细胞会从杆状变为圆形，甚至出现细胞极部裂解的现象。这种细胞变圆现象在高渗培养基中可被抑制，表明其原因是肽聚糖结构被削弱，无法抵抗细胞的膨压。

引人注目的是，同时过表达PBP1B能够有效抑制由桑A过表达引起的细胞变圆表型，而过表达PBP1B的激活因子LpoB则无此效果。这进一步支持了桑A的功能与PBP1B直接相关的观点，并提示桑A可能通过干扰PBP1B的活性来影响肽聚糖强度。

2.5 桑A过表达及缺失对肽聚糖结构的影响

为了直观评估桑A对肽聚糖结构的影响，研究采用快速冷冻-深度蚀刻电子显微镜（QFDE-EM）观察了纯化的肽聚糖。

结果显示，从桑A过表达细胞中纯化的肽聚糖，其孔洞的数量和尺寸均显著大于载体对照细胞。这直接证明了桑A过表达会削弱肽聚糖的网络结构。另一方面，在RMR背景下，sanA^M27R突变能显著减少肽聚糖中的孔洞数量和尺寸，部分修复了RMR导致的肽聚糖缺陷。

研究还比较了?sanA、?mrcA和?mrcB细胞的肽聚糖结构。?sanA细胞肽聚糖的孔洞尺寸显著小于野生型和?mrcA细胞，但与?mrcB细胞无统计学差异。这表明桑A对肽聚糖结构的影响依赖于PBP1B的存在：当PBP1B存在时，桑A的缺失（功能丧失）会使肽聚糖结构更加致密（孔洞变小）；而当PBP1B本身缺失时，肽聚糖结构已发生改变，桑A的缺失则不再产生额外影响。这一发现将桑A的功能与PBP1B活性紧密联系起来。

2.6 桑A突变抑制RMR缺陷的机制

综合以上数据，研究提出了桑A突变抑制RMR细胞缺陷的双重机制模型：其一，通过Rod复合体组分（如MreB, PBP2）的突变直接增强该复合体的肽聚糖合成活性；其二，则是通过桑A的功能丧失，解除其对PBP1B依赖的肽聚糖合成途径的抑制，从而补偿Rod复合体活性的不足。

支持这一模型的证据包括：PBP1B在Rod复合体功能减弱的RMR细胞中变得至关重要（?mrcB等位基因无法导入RMR细胞）；过表达PBP1B能轻微改善RMR细胞的生长；在已含有Rod复合体激活突变（如MreB^A125V）的细胞中过表达桑A，细胞会变细而非变圆，说明Rod复合体与PBP1B活性需要平衡。

3 结论

本研究首次发现并证实，桑A是一个与Rod复合体无关、但能抑制RodZ功能缺陷细胞表型的新型因子。桑A通过与肽聚糖合成酶PBP1B物理互作，负向调控其活性，从而影响肽聚糖的合成与修复。因此，PBP1B的功能受到激活因子LpoB和抑制因子桑A的正负双向精细调控。

桑A的功能丧失（sanA^M27R或缺失）能通过增强PBP1B依赖的肽聚糖合成途径，部分补偿因Rod复合体功能受损而导致的细胞壁缺陷，改善生长并减少肽聚糖结构中的孔洞。同时，这也使得细胞对万古霉素更加敏感，这可能与肽聚糖结构改变影响了其与外膜的连接有关，而非直接改变膜通透性。

总之，该研究揭示了桑A-PBP1B功能轴是调控细菌细胞壁完整性的一个新环节，为理解肽聚糖代谢的复杂网络、细菌形态维持以及抗生素敏感性机制提供了新的视角。这些发现与近期其他独立研究的结果相吻合，共同构建了一个关于桑A通过调控 Lipid II 利用和PBP1B活性来平衡肽聚糖合成的连贯模型。