用于检测正电子发射断层扫描（PET）示踪剂中Kryptofix 2.2.2含量的柱后衍生化高效液相色谱-紫外-紫外（HPLC-UV）方法

《Nuclear Medicine and Biology》：Post-column derivatization high-performance liquid chromatography-ultraviolet-ultraviolet (HPLC-UV) method for the detection of Kryptofix 2.2.2 content in Positron Emission Tomography (PET) tracers

本研究开发了一种后柱衍生化HPLC-UV方法用于测定PET示踪剂中的Kryptofix 2.2.2（K2.2.2），通过K2.2.2与Pb2+形成稳定复合物实现紫外吸收最大值红移（210 nm→254 nm），显著提升检测灵敏度（检测限0.5 μg·mL?1，线性范围1-100 μg·mL?1）。该方法在多个PET示踪剂中验证，具有高特异性、重现性（RSD<5%）和抗干扰能力，为同时分析放射性纯度和K2.2.2含量提供了高效工具。

　　

雷旭|董振豪|张红|安东尼奥·阿尔莱克斯·戈麦斯|瓦格纳·德·罗西|王静|阿里安·佩雷斯·纳里奥|何青刚

杭州吉瑞科技有限公司，中国浙江省杭州市，310058

摘要

本文开发了一种柱后衍生化高效液相色谱-紫外（HPLC-UV）方法，用于测定PET示踪剂中的Kryptofix 2.2.2（K2.2.2）。该方法利用K2.2.2与Pb²⁺之间的特异性配位作用，形成稳定的1:1主客体复合物。这种配位作用导致紫外吸收峰发生红移（从210 nm变为254 nm），从而实现灵敏检测。该方法克服了直接单方法检测K2.2.2时存在的性能不佳和适用范围狭窄的问题。

优化了色谱条件（柱流速：0.7 mL·min^?1；衍生化试剂流速：0.7 mL·min^?1；Pb²⁺浓度：50 μg·mL^?1），并对该方法进行了验证。结果表明该方法具有优异的线性（1–100 μg·mL^?1，r² ≥ 0.999）、高重复性（相对标准偏差（RSD）< 5%）和低检测限（0.5 μg·mL^?1）。该方法成功定量了[¹⁸F]FDG、[¹⁸F]AV45和[¹⁸F]DPA714中的K2.2.2，加标回收率为89%–105%。此外，该方法不受样品中常见成分（如氯化钠和抗坏血酸钠）的干扰。

该方法为多种PET示踪剂中放射性化学纯度和K2.2.2含量的同时分析提供了一种新型且高效的质量控制工具。

引言

正电子发射断层扫描（PET）示踪剂是核医学成像的重要组成部分，它们利用放射性标记的生物活性分子靶向特定的生物过程，以实现体内生理和生化过程的动态可视化[1]。这一能力显著提高了对肿瘤和神经退行性疾病的早期诊断准确性[2]。在人体使用前必须进行全面的质量控制（QC）测试，以防止药物引起的毒理学和药理学效应及其对PET测量的干扰[3]。PET示踪剂与传统药物相比具有独特的特点，包括放射性、短半衰期、批量小以及每剂成本高，这些因素使得传统的测试方法不适合用于放射性药物的QC[4]、[5]。因此，开发专门的QC方法和设备对于减少测试过程中样品消耗或放射性衰变造成的产品损失至关重要。

Kryptofix 2.2.2（4,7,13,16,21,24-六氧-1,10-二氮杂环[8.8.8]己烷，CAS 23978-09-8，以下简称K2.2.2）是一种笼状配体，在[¹⁸F]FDG（2-脱氧-2-[¹⁸F]氟葡萄糖）等¹⁸F标记放射性药物的常规合成中作为相转移催化剂，促进亲核[¹⁸F]氟化反应[6]、[7]、[8]。由于其高毒性（大鼠静脉注射半致死剂量LD₅₀ = 35 mg·kg^?1[9]、[10]，对最终制剂中残留的K2.2.2进行QC分析至关重要。包括美国药典（USP）、欧洲药典（EP）和中国药典在内的药典标准规定了[¹⁸F]FDG注射剂中K2.2.2的允许限量[11]、[12]、[13]。

已经开发了多种分析方法用于测定[¹⁸F]FDG中的K2.2.2含量，包括薄层色谱（TLC）[14]、紫外（UV）光谱法[15]、氮磷检测气相色谱（GC-NPD）[16]、比色斑点测试[11]、[17]、高效液相色谱（HPLC）[18]和液相色谱-串联质谱（LC/MS/MS）[19]。结合UV检测的HPLC在检测PET示踪剂中的K2.2.2时具有显著优势，因为它灵敏度高、仪器紧凑、样品需求少且分析时间快。值得注意的是，该技术能够同时测定放射性化学纯度（RCP）和K2.2.2含量，大幅提高了QC工作的效率。然而，K2.2.2的紫外吸收较低，直接用HPLC检测时容易受到干扰，导致结果可靠性降低。

K2.2.2具有独特的三维腔结构（直径=2.8 ? [20]），可通过离子-偶极相互作用选择性地与金属离子配位。当主体腔和客体离子的几何尺寸匹配时（例如与Pb²⁺，直径=2.4 ? [21]），会形成化学计量的稳定1:1主客体复合物[22]、[23]、[24]。这种配位作用导致紫外吸收发生红移，使得在254 nm处可以实现灵敏检测。赵某[25]开发了一种利用K2.2.2-Pb²⁺复合物通过UV检测的方法来测定[¹⁸F]FDG中的K2.2.2。该方法受温度影响小，在常温下可快速达到最大吸光度，并且生成适合长期储存的稳定产物。然而，K2.2.2-Pb²⁺复合物的吸收峰可能与其他PET示踪剂的主要产物的吸收峰重叠，这限制了该方法在某些示踪剂（如[¹⁸F]AV45（4-[(E)-2-(6-{2-[2-(2-[¹⁸F]氟氧基)乙氧基]乙氧基}-3-吡啶基)乙烯基]-N-甲基苯胺）和[¹⁸F]DPA714（N,N-二乙基-2-[4-(2-[¹⁸F>氟氧基)苯基]-5,7-二甲基吡唑[1,5-α]吡啶-3-乙酰胺））中的应用。

我们开发了一种柱后衍生化HPLC-UV方法，用于定量PET样品中的K2.2.2-Pb²⁺复合物。该方法利用HPLC的分离能力，在K2.2与Pb²⁺发生化学转化（衍生化）之前将其从样品基质中分离出来。通过将K2.2.2与后续形成的Pb²⁺复合物分开，该方法保持了高分析灵敏度并提高了方法特异性。其高效的工作流程和结构多样性为结构多样的PET示踪剂提供了一种新型的无干扰QC方法。

材料

K2.2.2标准品购自德国ABX GmbH（Radeberg）。HPLC级乙腈和三氟乙酸（TFA）购自中国上海的Aladdin公司。除非另有说明，所有其他化学品均为分析级。K2.2.2和硝酸铅（Pb(NO₃)₂的储备溶液在水中的浓度为1000 μg·mL^?1，随后用水稀释至所需浓度。所有水溶液均使用18.2 MΩ的去离子水制备。

K2.2.2-Pb²⁺复合物的光谱分析

最初，研究重点关注Pb²⁺对K2.2.2配合物光谱性质的影响。加入Pb²⁺后，K2.2.2的紫外吸收增强，其特征吸收峰从210 nm移至254 nm。图2A显示了K2.2.2、Pb²⁺和K2.2.2-Pb²⁺复合物的特征吸收峰和强度。与单独的K2.2相比，与Pb²⁺的配位显著提高了检测灵敏度。此外，吸收峰的移动也表明了...

结论

本研究建立了一种基于K2.2.2与Pb²⁺之间高度选择性配位反应的柱后衍生化HPLC-UV方法，用于定量PET示踪剂中的K2.2.2。该方法在1–100 μg·mL^?1范围内表现出良好的线性，显示出比UV光谱法更高的方法稳定性和检测限。使用该方法分析相同的[¹⁸F]FDG样品批次，得到K2.2.2浓度为1.18 ± 0.06 μg·mL^?1，显示出显著的优势。

CRediT作者贡献声明

雷旭：撰写——初稿、方法学、研究、数据管理、概念构思。董振豪：撰写——初稿、方法学、研究。张红：监督、资源提供、项目管理、方法学、资金获取。安东尼奥·阿尔莱克斯·戈麦斯：撰写——审稿与编辑、监督、数据管理。瓦格纳·德·罗西：撰写——审稿与编辑、方法学、数据管理。王静：资源提供、资金获取、正式分析。阿里安·佩雷斯·纳里奥：撰写——

资助

本研究得到了以下资助的支持，包括国家自然科学基金重大研究仪器开发项目（项目编号：32027802）、浙江大学仪器开发项目（项目编号：YQZX-B202407）、浙江省“灵岩”研发计划（项目编号：2024C03100）以及CNPq（INTERAS 406761/2022-1；GD 174673/2023-0；DT 305237/2024-1）。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

作者感谢浙江大学第二附属医院和吉瑞科技有限公司的放射化学团队提供的正电子发射断层扫描（PET）示踪剂。