《Plant Science》：Overexpression of
PbWRKY66 negatively regulate phosphate uptake and root-to-shoot distribution in
Arabidopsis
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低磷胁迫下 Phoebe bournei PbWRKY66 的分子调控机制及其在磷吸收中的作用。通过表达分析、GUS 基因驱动实验及拟南芥过表达株系研究，发现 PbWRKY66 在叶片高表达而在根部受抑制，其蛋白定位于细胞核并具有转录激活活性。过表达 PbWRKY66 的拟南芥在低磷条件下表现出根系伸长受阻、植株变小及花青素积累增多，且地下部总磷和叶片无机磷含量显著降低。同时，PbWRKY66 上调磷转运负调控因子 AtSPX1 表达，而抑制 AtPHT1;1、AtPHT1;4 和 AtPHO1 等磷转运基因。研究揭示了 PbWRKY66 作为磷稳态负调控因子的作用，为培育耐低磷树种提供理论依据。
李梦丹|孙文宇|吴梦杰|李芳艳|曹珍|刘年|程龙军
浙江省农林大学森林食品资源开发与利用国家重点实验室，中国杭州311300
摘要
Phoebe bournei是一种原产于中国南部的珍贵木材物种，因其经济和生态价值而闻名。然而，该地区酸性土壤中普遍存在的低磷水平严重限制了P. bournei林场的生产力。因此，阐明P. bournei中磷吸收、转运和稳态的分子机制对于培育耐低磷条件的品种至关重要。本研究聚焦于PbWRKY66，这是一种在Phoebe bournei中鉴定并表征的II类WRKY转录因子。在缺磷条件下，PbWRKY66在叶片中的表达显著增强，而在根部则受到强烈抑制。PbWRKY66蛋白定位于细胞核，并表现出转激活活性。不同组织的表达分析显示，PbWRKY66转录本主要在茎和叶片中积累，而由PbWRKY66启动子驱动的GUS报告基因在叶片脉部、茎和根的维管组织、花梗基部以及侧根尖表现出强烈的启动子活性。过表达PbWRKY66的转基因拟南芥品系对缺磷的敏感性更高，表现为根伸长减少、地上部分变小以及花青素积累增加。与野生型相比，转基因品系的茎和根中的总磷含量也显著降低，叶片中的无机磷酸盐含量也减少。此外，在PbWRKY66过表达的根系中，与磷吸收和转运密切相关的AtPHT1;1、AtPHT1;4和AtPHO1的表达显著下调，而作为磷酸盐饥饿反应负调控因子的AtSPX1则上调。总体而言，这些发现表明PbWRKY66在控制磷的吸收、从根部向茎部的转运以及磷酸盐饥饿信号传导中起负调控作用，从而有助于植物在缺磷胁迫下的磷稳态调节。
引言
植物的生长发育严重依赖于磷（P），这是一种必需的大量营养元素，是核酸、蛋白质和脂质等生物分子的关键结构单元。除了其结构作用外，磷还在许多关键的生理和生化过程中发挥着不可或缺的作用，包括光合作用、呼吸作用、糖酵解、氧化还原调节、信号转导和酶活性调控（Paz-Ares等，2022年；Prathap等，2022年）。为了维持最佳的生长和发育，植物必须从周围环境中获取足够的磷，主要形式是土壤中的可溶性无机磷酸盐（Pi）。然而，土壤中可溶性Pi的可用性往往受到严重限制，因为Pi容易与铁、铝或钙等金属离子形成不溶性复合物，从而降低了其对植物的生物利用度。为了缓解这一限制，磷肥在农业和林业系统中被广泛使用。尽管如此，植物的吸收效率仍然很低，通常只有10-15%的施用磷酸盐被作物吸收，大部分则被固定在土壤中或流入水生生态系统。这种低效率不仅增加了作物生产的成本，还导致了环境退化，包括水体富营养化和土壤质量下降（Etesami等，2021年；Prathap等，2022年）。尽管磷对植物生长和发育非常重要，但植物组织中磷的过度积累会导致毒性症状，如黄化、生长受阻、叶片早衰和次生营养素失衡（Hawkins等，2008年）。因此，维持植物内的磷稳态对其健康至关重要，需要严格调控磷的吸收、分配和内部循环（Liang等，2014年）。因此，全面了解控制磷吸收和稳态的分子网络至关重要。这样的见解可以指导遗传改良策略，以提高植物对磷的利用效率，从而支持可持续的农业和林业实践，同时减少对外部磷投入的依赖。
为了协调磷的吸收和稳态，植物发展出了复杂的信号通路和适应性反应（Feng等，2025b）。当感知到外部磷水平低时，植物会启动局部磷饥饿反应（PSRs），包括改变根系结构并上调磷酸盐转运基因的表达，从而增加磷的吸收能力。同时，由内部磷耗竭触发的系统性反应会调整生物量分配（例如，增加根与茎的比例），增强组织间的磷转运，并激活从液泡池中重新动员磷的机制（Yang等，2024年）。在低磷条件下，植物不仅试图从土壤中最大限度地吸收磷，还通过提高转运效率、分配和循环过程来优化内部磷的利用。潜在的分子网络非常复杂，涉及大量的磷转运蛋白，包括 constitutively 表达的低亲和力类型和在磷饥饿条件下诱导的高亲和力转运蛋白。此外，如SPX结构域蛋白（SYG1/Pho81/XPR1家族）和硫酸盐转运蛋白（SULTR）类似蛋白也参与磷的感知和转运调控（Gu等，2016年；Secco等，2012年；Yamaji等，2017年）。此外，包括MYB、bHLH、ERF和锌指蛋白在内的多个转录因子家族也被认为通过调节根系发育、转运蛋白表达和养分分配来介导PSRs（Chen等，2022a；Devaiah等，2007b；Dong等，2019年；He等，2021年；Pan和Hu，2020年；Slocombe等，2023年；Zhang等，2025年）。
此外，一组被广泛认为参与植物发育和适应过程的WRKY转录因子也被证明参与了植物磷的吸收和稳态调控（Yang等，2025年）。例如，AtWRKY45和AtWRKY75在低磷条件下通过激活磷酸盐转运基因的表达来促进磷的吸收（Devaiah等，2007a；Wang等，2014年）。FtWRKY28通过激活AtPH1;1、AtPH1;4和AtPHO1在拟南芥转基因品系中的表达来增强磷的吸收（Liao等，2025年），而OsWRKY74在水稻中具有类似的功能（Dai等，2016年）。相反，AtWRKY42和AtWRKY6在磷充足条件下通过抑制PHO1的表达来限制磷向茎部的过度转运（Chen等，2009年；Su等，2015年）。在水稻中，OsWRKY10在外部磷充足时通过抑制OsPHT1;2的表达来抑制磷的吸收（Wang等，2023b）。此外，ElWRKY48也通过抑制Euphorbia lathyris中的ElPHT1来负调控磷酸盐的吸收（Zhao等，2025年）。苹果中的MdWRKY39通过抑制MdPHT1;7的表达来减少从环境中的磷吸收（Zhou等，2023年）。然而，杨树中的PdeWRKY6和PdeWRKY65通过在不同磷条件下差异性地调节PdePHT1;9的表达来精细调节磷的稳态，平衡根部和茎部之间的磷分配（Yang等，2022年）。
尽管在包括水稻和拟南芥在内的草本模式植物中，磷吸收的机制已有相当大的进展，但对于木本植物的相关研究仍相对有限。然而，木本和草本植物在养分吸收、储存和长期利用策略上存在显著差异（Pan等，2022年）。研究木本植物中磷吸收和调控的分子基础对于扩展我们对不同植物类群中磷营养的理解以及提高植物磷吸收和利用的效率至关重要。
P. bournei是一种原产于中国南部的常绿硬木树种，主要分布在浙江省、福建省、广东省和江西省（Wang等，2024年）。该物种因其致密的、耐腐的木材、精细的纹理和芳香的气味而备受重视，成为高端家具和装饰应用的理想材料（Han等，2022年）。然而，由于自然再生缓慢和大规模的森林砍伐，野生种群数量显著下降，使其在中国被列为国家保护植物物种（Feng等，2025a）。近年来，对P. bournei木材需求的增加和可持续林业的发展推动了人工林的扩展。然而，该物种对养分的需求较高，而中国南部酸性土壤中磷的生物利用度低是其成功栽培的主要限制（Xiong等，2023年）。因此，阐明P. bournei低磷耐受性的分子机制具有重要的理论和应用价值。
在这里，我们报道了来自P. bournei的一种WRKY转录因子，命名为PbWRKY66（GenBank登录号MW473807）。表达分析显示，在缺磷条件下，PbWRKY66在叶片中表达增强，而在根部受到抑制，这表明其在磷信号传导或稳态中可能发挥作用。为了探讨其功能，我们使用过表达PbWRKY66的转基因拟南芥品系在低磷条件下对其基因结构、蛋白特征、表达动态和功能效应进行了全面分析。我们的发现为P. bournei中的磷调控提供了新的见解，并为未来培育耐低磷品种提供了分子基础，从而支持这一具有经济和生态重要性的树种的可持续发展。
部分摘录
植物材料和缺磷处理
将两个月大的P. bournei半同胞家族的幼苗移植到稀释至四分之一的Hoagland营养液中进行水培生长，并在生长室（Snijders，MC1000，荷兰）中按照以下条件进行培养：光照强度为50 μmol·m?2·s?1，14小时光照/10小时黑暗的周期，温度为28°C/26°C，相对湿度为65%。经过2周的适应期后，从每组中选取5株生长均匀的幼苗进行实验
PbWRKY66在P. bournei幼苗中对缺磷的反应
鉴于WRKY转录因子在植物适应磷缺乏中的潜在作用，我们对P. bournei进行了全基因组范围内的鉴定，并通过转录组分析筛选出对长期缺磷有响应的候选因子。其中，属于WRKY家族IIa亚组的PbWRKY66表现出明显的组织特异性表达模式：在缺磷条件下，其在叶片中的转录本丰度显著上调，而在根部则下调
讨论
在WRKY转录因子家族中，具有两个WRKY基序和一个C2H2型锌指结构域的I组成员被认为是祖先形式。而III组WRKY蛋白含有一个WRKY基序和一个C2HC型锌指结构域，代表了最近进化出来的谱系。II组蛋白每个都包含一个WRKY基序和一个C2H2型锌指结构域，是最大的组，进一步分为五个亚组：IIa、IIb、IIc、IId等
CRediT作者贡献声明
李梦丹：方法学、研究、数据管理。孙文宇：写作——审稿与编辑、软件、方法学、研究。吴梦杰：可视化、软件、形式分析、数据管理。李芳艳：写作——审稿与编辑、可视化、数据管理。曹珍：写作——审稿与编辑、可视化。刘年：写作——审稿与编辑。程龙军：写作——初稿撰写、监督、资金获取、概念构思。
利益冲突声明
作者声明以下可能的利益冲突/个人关系：程龙军报告称获得了浙江省科技部的财政支持。如果还有其他作者，他们声明没有已知的可能影响本文工作的利益冲突或个人关系。
致谢
本工作得到了浙江省重点科技项目（2021C02070-6）的支持。
利益冲突声明
本文未声明任何可能影响研究的利益冲突或个人关联。
