《Nature Communications》：Spatial perturb-seq: single-cell functional genomics within intact tissue architecture
编辑推荐：
推荐阅读：为了在完整组织架构中同时解析多个基因的功能，研究人员开发了Spatial Perturb-Seq技术，并将其应用于小鼠脑内敲除神经退行性疾病风险基因。该研究实现了在体多基因功能筛选，规避了细胞处理步骤带来的偏差，揭示了细胞自主效应与细胞间微环境效应，并鉴定了导致神经元间通讯通路失调的候选基因，为在体功能基因组学研究提供了新范式。
人类的大脑是一个极其精密的系统，其功能依赖于各种细胞类型在三维空间中的精确协作。然而，当大脑罹患神经退行性疾病，如阿尔茨海默病或帕金森病时，这种协作网络便会逐渐崩溃。科学家们已经鉴定出许多与这些疾病相关的风险基因，但一个核心难题长期悬而未决：这些基因在完整无缺的脑组织中，究竟如何影响特定类型的细胞？它们的变化又如何通过细胞间的“对话”波及整个神经网络？传统的实验方法往往需要将组织打散成单个细胞进行分析，这一过程不仅破坏了细胞赖以生存的复杂三维微环境，还可能因为处理步骤导致某些脆弱的细胞类型丢失，使研究结果偏离真实情况。
为了直接窥探在体、原位状态下的基因功能，一项发表在《Nature Communications》上的研究带来了突破。研究人员开发了一种名为“空间扰动测序（Spatial Perturb-Seq）”的新技术，巧妙地将CRISPR基因编辑系统与空间转录组技术结合起来。利用这项技术，他们如同在完整的大脑组织中植入了一枚枚“基因探针”，能够同时靶向敲除多个神经退行性疾病风险基因，并直接在细胞原有的“住所”里，观察每个细胞的基因表达变化及其与邻居细胞的空间关系。这项研究不仅成功绕开了破坏性细胞处理的瓶颈，更首次在空间维度上系统揭示了基因敲除对细胞自身以及周围微环境产生的双重影响。
主要技术方法
研究人员利用腺相关病毒（AAV）载体，在小鼠大脑特定区域递送CRISPR-Cas9系统及靶向多个疾病风险基因的向导RNA（gRNA），实现多重基因敲除。随后，结合基于测序的空间转录组技术，对包含扰动细胞及周围正常细胞的完整脑组织切片进行分析，从而在保留空间位置信息的前提下，解析单细胞水平的转录组变化。
研究结果
Spatial Perturb-Seq enables in situ pooled CRISPR screening within intact tissues
（空间扰动测序能够在完整组织内实现原位CRISPR筛选）
研究人员开发了Spatial Perturb-Seq技术平台。通过将CRISPR-Cas9系统的关键组件和携带特异gRNA的条形码文库包装进腺相关病毒（AAV），并注射到小鼠大脑，实现了在体、多基因并行敲除。随后，他们采用基于测序的空间转录组方法，对脑组织切片进行分析。该技术的关键创新在于，它能够从同一张组织切片中，同时捕获每个细胞的基因表达谱、其携带的gRNA身份条形码以及细胞在组织中的精确空间坐标。这使得研究人员能够在完整无缺的脑组织中，将特定的基因扰动事件与下游的分子表型及细胞位置信息一一对应起来，实现了真正的原位功能基因组学筛选。
Spatial Perturb-Seq reveals cell-type-specific cell autonomous effects
（空间扰动测序揭示了细胞类型特异性的细胞自主效应）
利用该技术对多个神经退行性疾病风险基因进行功能筛选后，研究人员发现了显著的细胞自主效应。例如，敲除一个名为Grn（颗粒蛋白前体）的基因，在少突胶质前体细胞（OPCs）中引发了强烈的转录组反应，但在同一组织区域内的兴奋性神经元中则影响甚微。这表明，同一个基因在不同类型的细胞中扮演着截然不同的角色，其功能高度依赖于细胞所处的内在状态。空间扰动测序能够精确地捕获这种细胞类型特异性，这是传统体外或混合细胞群分析难以做到的。
Spatial Perturb-Seq detects changes in cell-cell communication
（空间扰动测序检测到细胞间通讯的变化）
除了影响细胞自身，基因敲除还会改变细胞与其微环境的互动。通过分析空间相邻细胞对的配体-受体表达模式，研究发现Grn基因在OPCs中的敲除，显著影响了OPCs与邻近的少突胶质细胞之间的通讯信号。具体表现为，一些促进髓鞘形成的信号通路活性下降。这揭示了基因扰动如何通过改变特定细胞类型的信号“输出”，进而重塑局部细胞网络的相互作用。
Mapping the cellular microenvironment of perturbed cells
（绘制扰动细胞的微环境图谱）
通过深入分析以每个基因敲除细胞为中心的局部细胞群落组成，研究发现扰动改变了细胞周围的“邻居”构成。与野生型细胞相比，Grn敲除的OPCs周围，少突胶质细胞的数量相对减少，而小胶质细胞（大脑的免疫细胞）的数量则增多。这种微环境组成的空间变化，为理解基因缺陷如何影响细胞生态位、进而可能驱动疾病早期病理改变提供了直接的形态学证据。
Spatial Perturb-Seq identifies genes that perturb neuronal intercellular communication
（空间扰动测序鉴定出干扰神经元间通讯的基因）
研究进一步将分析重点扩展到神经元之间的通讯网络。通过筛选，发现了一个名为Mapt（微管相关蛋白tau）的基因敲除，会特异性干扰兴奋性神经元之间的特定通讯通路，而这些通路与突触功能密切相关。同时，另一个风险基因Abca7的敲除，则影响了抑制性神经元的通讯模式。这证明，不同的风险基因可能通过破坏不同神经元亚型间的特定“对话”线路，共同促成神经网络功能的异常，为理解神经退行性疾病中突触功能障碍的分子起源提供了新线索。
研究结论与意义
本研究开发的Spatial Perturb-Seq技术，是一项强大的在体功能基因组学工具。它首次实现了在完整组织架构内，对多基因进行单细胞分辨率的功能解析，并同时捕获由此引发的细胞自主效应与细胞间微环境效应。应用该技术于小鼠大脑的神经退行性疾病风险基因筛选，成功揭示了这些基因功能的细胞类型特异性，绘制了基因敲除导致的局部细胞群落和通讯网络的空间变化图谱，并鉴定出可能直接损害神经元间通讯的关键候选基因。这项研究的重大意义在于，它突破了传统功能基因组学研究对组织解离的依赖，将基因功能研究置于更接近生理真实的复杂空间环境中，为深入理解神经系统及其他器官中基因型-空间表型-细胞互作之间的关系，尤其是在疾病背景下，提供了一个革命性的研究框架。
