《Nature Communications》：Non-hydrolyzable acetyllysine analogs to study protein acetylation in vitro and in cells
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为研究蛋白质乙酰化（AcK）在细胞内的稳定功能影响，研究者开发了不可水解的乙酰赖氨酸类似物——酮赖氨酸 (KeK)。将其位点特异性地引入泛素 (ubiquitin) 和抑癌蛋白 p53，验证了其能模拟 AcK 的结构与功能，且在细胞内稳定存在，有效克服了乙酰化易被去乙酰化酶移除的局限。该成果为在细胞环境中精确解析蛋白质乙酰化的功能提供了有力工具。
在生命活动的精密调控网络中，蛋白质翻译后修饰（PTM）如同精妙的分子开关，决定着蛋白质的功能、定位与命运。其中，赖氨酸乙酰化（lysine acetylation）在真核细胞中扮演着至关重要的调控角色，广泛参与基因表达、代谢、信号传导等过程。然而，深入理解乙酰化对特定蛋白质的具体功能影响，却是一个巨大的科学挑战。困难主要来自两个方面：其一，同一个赖氨酸残基可能同时是多种不同修饰（如甲基化、泛素化等）的靶点，这使得传统的突变研究（例如将赖氨酸突变为精氨酸以模拟去乙酰化状态）结果难以准确归因于乙酰化的缺失；其二，虽然通过遗传密码子扩展技术（genetic code expansion）能够在蛋白质中位点特异性地引入乙酰赖氨酸（acetyllysine, AcK），但在活细胞内，引入的乙酰基团会被活跃的去乙酰化酶（deacetylases）迅速移除，导致 AcK 状态无法稳定维持，从而难以观察其长期或稳定的功能效应。
为了解决这些瓶颈，一项发表在《Nature Communications》上的研究为我们带来了新的希望。研究人员将目光投向了开发一种能够“欺骗”细胞去乙酰化系统的分子工具——不可水解的乙酰赖氨酸类似物。他们的核心思路是：如果能找到一种在结构上高度模拟 AcK，但又不会被去乙酰化酶识别并切割的分子，将其精确地插入目标蛋白质的特定位点，就有望在活细胞内创造一个稳定、持久的“乙酰化模拟”状态，从而清晰地揭示乙酰化本身的功能后果。
为了验证这一设想，研究团队首先选择了泛素（ubiquitin）作为模型蛋白。他们利用遗传密码子扩展技术，成功地在泛素的特定位点分别嵌入了天然的 AcK 和其设计的一种类似物——酮赖氨酸（ketolysine, KeK）。通过核磁共振（NMR）等结构生物学手段进行比较分析，他们发现 KeK 的引入对蛋白质三维结构造成的影响与 AcK 高度相似。更重要的是，在功能性实验中，带有 KeK 的泛素与其结合蛋白的相互作用模式也与 AcK 版本基本一致。这些体外实验结果表明，KeK 在结构和功能上都是一个合格的 AcK“替身”。
然而，真正的考验在细胞内。研究人员将战场转向了更具生物学意义的抑癌蛋白 p53。p53 的活性受到多个位点乙酰化的精细调控，是研究乙酰化功能的绝佳模型。同样运用遗传密码子扩展技术，他们在细胞内成功表达了在关键乙酰化位点分别含有 AcK 和 KeK 的 p53 蛋白。结果出现了决定性的分叉：带有 AcK 的 p53 很快就被细胞内的去乙酰化酶去乙酰化，恢复了非乙酰化状态；而带有 KeK 的 p53 则表现出了卓越的稳定性，其“乙酰化模拟”状态得以长期维持。这种稳定性差异直接导致了功能上的不同：只有引入 KeK（而非 AcK）的 p53，才能有效且稳定地影响下游靶基因的转录激活。这完美证明了 KeK 能够克服 AcK 在细胞内的不稳定性，从而可靠地报告乙酰化对蛋白质功能（如转录调控）的真实影响。
概括而言，这项研究主要运用了以下关键技术方法：1）遗传密码子扩展技术，用于在蛋白质合成过程中位点特异性地插入非天然氨基酸（AcK 和 KeK）；2）核磁共振波谱学，用于在原子水平解析和比较蛋白质（泛素）嵌入 AcK 或 KeK 后的三维结构变化；3）基于细胞系的蛋白质表达与检测技术，在人类细胞中表达修饰后的 p53 蛋白；4）蛋白质修饰稳定性分析，通过免疫印迹等手段追踪细胞内 AcK 和 KeK 的存留情况；5）转录活性报告基因检测，定量评估 p53 乙酰化模拟状态对其转录调控功能的影响。
研究结果
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KeK 在泛素中能有效模拟 AcK 的结构与功能
研究人员在泛素的特定位点引入 AcK 或 KeK。核磁共振结构分析表明，KeK 的引入所引起的泛素局部构象扰动与 AcK 引入所产生的扰动高度相似。此外，表面等离子体共振实验显示，携带 KeK 的泛素与其效应蛋白的结合亲和力与携带 AcK 的版本无显著差异。这些结果证明，在体外环境下，KeK 可以作为 AcK 的功能性类似物。
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AcK 与 KeK 均能在细胞内的 p53 蛋白中实现位点特异性嵌入
利用遗传密码子扩展技术，研究团队在人类细胞中成功表达了在特定赖氨酸位点（K382）分别包含 AcK 或 KeK 的 p53 蛋白。这证实了该技术体系适用于在复杂的细胞内环境中对重要调控蛋白进行精确的化学修饰。
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KeK 在细胞内具有代谢稳定性，而 AcK 会被去乙酰化
对细胞内 p53 蛋白的修饰状态进行时程监测发现，带有 AcK 的 p53 其乙酰基信号迅速衰减，表明其被内源性去乙酰化酶有效移除。相反，带有 KeK 的 p53 其修饰信号始终保持稳定，证明 KeK 能够抵抗去乙酰化酶的催化作用，是一种“不可水解”的修饰。
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KeK 的稳定嵌入能影响 p53 介导的转录，而 AcK 不能
功能实验表明，仅在 p53 的 K382 位点嵌入 KeK（而非 AcK）时，才能显著且稳定地改变 p53 对一系列下游靶基因（如 p21、PUMA）的转录激活能力。这直接将 KeK 所提供的稳定“乙酰化模拟”状态与特定的生物学功能输出联系起来，明确了该位点乙酰化对 p53 转录活性的调节作用。
结论与意义
本研究成功开发并验证了酮赖氨酸（KeK）作为一种新型、不可水解的乙酰赖氨酸（AcK）类似物，用于在活细胞环境中研究蛋白质乙酰化功能。研究得出结论：1）KeK 在结构和功能上能很好地模拟天然 AcK；2）KeK 的关键优势在于其能抵抗细胞内去乙酰化酶的催化，从而在目标蛋白上形成稳定的化学修饰；3）这种稳定性使得 KeK 能够可靠地揭示乙酰化对蛋白质功能的真实影响，如在 p53 转录调控中的作用，而传统的 AcK 嵌入方法则因修饰的不稳定性而无法达成此目的。
这项工作的意义深远。它为解决蛋白质翻译后修饰功能研究中的经典难题——修饰的动态性与特异性——提供了一个强有力的化学工具。KeK 策略克服了天然修饰不稳定和多重修饰干扰的局限，使得研究人员能够在更接近生理条件的细胞环境中，对特定蛋白质的特定乙酰化事件进行“冻结”观察，从而精确剖析其功能机制。这不仅深化了我们对 p53 等关键蛋白乙酰化调控的理解，更重要的是，它所确立的研究范式可推广至其他蛋白质和其他类型的翻译后修饰研究，为全面解码生命活动的“修饰密码”打开了新的技术窗口。
