《Redox Biology》：Identification of Pinostilbene as a Natural STING Agonist that Triggers FTH1 Degradation
via K48-Ubiquitination to Induce Ferroptosis in Non-Small Cell Lung Cancer
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本研究针对非小细胞肺癌（NSCLC）治疗中面临的耐药性和毒性挑战，聚焦铁死亡这一新兴的治疗策略。研究人员识别并深入探索了天然芪类化合物Pinostilbene作为新型STING激动剂的作用。研究表明，Pinostilbene有效激活STING/TBK1/IRF3通路，并通过触发铁储存蛋白FTH1的K48-泛素化降解，增加细胞内不稳定铁池，从而显著增强肺癌细胞对RSL3诱导的铁死亡的敏感性。体内实验进一步证实其与RSL3联用能协同抑制肿瘤生长，并重塑肿瘤免疫微环境。该研究为NSCLC治疗提供了具有多重作用机制的新型候选药物，意义重大。
非小细胞肺癌（NSCLC）仍然是全球癌症相关死亡的主要原因之一。虽然治疗方法在不断进步，但晚期患者的预后依然不佳，亟需新颖有效的治疗策略。近年来，一种被称为“铁死亡”的程序性细胞死亡方式，因其在多种癌症中克服耐药性的潜力而备受关注。它是一种铁依赖性的、以脂质过氧化为特征的细胞死亡形式。与此同时，干扰素基因刺激因子（STING）通路作为先天免疫系统的核心，其激活不仅能诱导抗病毒和抗肿瘤免疫反应，也与铁死亡的发生存在有趣的关联。然而，现有的STING激动剂（如环状二核苷酸）往往因亲水性导致细胞渗透性差、易被降解以及可能引发严重的全身性炎症副作用等问题，限制了其临床应用。因此，寻找和开发具有更佳药理学特性的新型STING激动剂，成为转化STING通路治疗潜力的关键。
这项发表在《Redox Biology》期刊上的研究，旨在鉴定并表征具有增强治疗潜力的新型STING激动剂化合物。研究团队通过高通量筛选，成功从天然产物库中识别出Pinostilbene（一种天然芪类化合物），并系统性地研究了其作为STING激动剂，通过诱导铁死亡来抗击NSCLC的作用机制。研究发现，Pinostilbene不仅能有效激活STING通路，还能显著增强NSCLC细胞对经典铁死亡诱导剂RSL3的敏感性。其核心机制在于，Pinostilbene通过一种不依赖于NCOA4介导的铁蛋白自噬的新途径，促进铁储存蛋白FTH1（Ferritin Heavy Chain 1）发生K48-连接的泛素化修饰，进而被蛋白酶体降解。FTH1的降解释放了细胞内储存的铁，增加了不稳定的铁池，从而为驱动脂质过氧化和铁死亡提供了关键前提。在小鼠体内实验中，Pinostilbene单药或与RSL3联用均表现出显著的抗肿瘤效果，且无明显全身毒性。其疗效与STING通路的激活、FTH1的下调以及铁死亡标志物4-HNE（4-羟基壬烯醛）的增加相一致。更重要的是，Pinostilbene还能上调炎性细胞因子，促进肿瘤杀伤性CD8+T细胞的浸润和激活，并驱动巨噬细胞向抗肿瘤的M1型极化，重塑了肿瘤免疫微环境。这项研究揭示了Pinostilbene作为一种有前景的NSCLC治疗药物的潜力，其作用机制涵盖了铁死亡增敏和免疫刺激等多个层面。
为开展上述研究，作者运用了多种关键技术方法。在体外细胞实验中，主要使用了人类NSCLC细胞系（H1299和A549）和小鼠Lewis肺癌细胞。研究通过IFNB1启动子驱动的荧光素酶报告基因系统进行高通量筛选以鉴定STING激动剂。细胞活性通过CCK-8法检测；细胞死亡和脂质过氧化分别使用Annexin V/PI染色和C11-BODIPY探针评估；细胞内Fe2+和线粒体Fe2+水平分别通过FerroOrange和Mito-FerroGreen探针检测；线粒体形态通过透射电子显微镜（TEM）观察；线粒体膜电位使用TMRM探针测量。分子机制层面，采用免疫荧光观察p-IRF3的核转位；通过蛋白质免疫印迹（Western Blot）和实时定量聚合酶链式反应（qPCR）分析关键蛋白和基因的表达；利用环己酰亚胺（CHX）追踪实验、蛋白酶体/溶酶体抑制剂（MG132, E64/Pepstatin）以及免疫共沉淀技术（Co-IP），探究了FTH1蛋白的稳定性和泛素化降解途径。在体内实验中，构建了C57BL/6小鼠的Lewis肺癌皮下移植瘤模型，通过腹腔注射给药评估药效。通过免疫组织化学（IHC）和免疫荧光分析肿瘤组织中FTH1、4-HNE、Ki67及免疫细胞标志物的表达；通过流式细胞术详细分析了肿瘤微环境中各类免疫细胞（如CD8+T细胞、巨噬细胞）的亚群和功能状态。
3.1. Pinostilbene有效激活NSCLC细胞中的STING/TBK1/IRF3通路
通过基于IFNB1启动子的报告系统，从超过1400种化合物中筛选出Pinostilbene，发现其能最强效地激活IFNB1转录。蛋白质免疫印迹和免疫荧光证实，Pinostilbene能以浓度依赖的方式上调STING、TBK1和IRF3的磷酸化水平，并促进p-IRF3的核转位。qPCR结果显示，Pinostilbene剂量依赖性地增强了STING通路下游关键细胞因子（如IFNB1、IFIT1、ISG15、CXCL10等）的表达。这些结果表明Pinostilbene被鉴定为一种能有效激活肺癌细胞中STING/TBK1/IRF3通路的新型STING激动剂。
3.2. Pinostilbene增强NSCLC细胞对RSL3介导的铁死亡的敏感性
通过CCK-8和Annexin V/PI染色实验，发现Pinostilbene能显著增强RSL3对H1299细胞活力的抑制，并增加细胞死亡。使用C11-BODIPY探针检测到Pinostilbene显著增强了RSL3介导的脂质过氧化。同时，利用FerroOrange探针和比色法铁离子检测试剂盒，证实Pinostilbene处理显著增加了细胞内游离Fe2+水平。这些结果共同证实了Pinostilbene能有效增强NSCLC细胞对RSL3诱导的铁死亡的敏感性。
3.3. Pinostilbene促进NSCLC细胞中的铁死亡样线粒体损伤
透射电镜观察显示，Pinostilbene与RSL3联用比单用RSL3引起了更严重的线粒体体积缩小和嵴结构破坏。通过MitoTracker Green/Red双染、MitoSOX Red（检测线粒体活性氧）、Mito-FerroGreen（检测线粒体Fe2+）和TMRM（检测线粒体膜电位）等流式细胞术分析，进一步证实了Pinostilbene加剧了RSL3引起的线粒体损伤、线粒体活性氧产生、线粒体铁积累和线粒体膜电位降低，这些都是铁死亡的典型特征。
3.4. 在RSL3刺激下，Pinostilbene通过不依赖NCOA4-铁蛋白自噬的途径加速FTH1降解
机制探索发现，Pinostilbene在RSL3存在时，能显著下调关键铁储存蛋白FTH1的蛋白质水平，而同时其mRNA水平并未下调甚至有所上调，提示存在转录后调控。蛋白质免疫印迹分析表明，这种下调不依赖于自噬标志物LC3B II和铁蛋白自噬关键蛋白NCOA4的表达变化。此外，Pinostilbene对NRF2（FTH1的关键转录因子）及其下游靶基因的调控，以及对铁调节蛋白IRP1/2的调控，均无法合理解释FTH1蛋白的下调。这些结果共同指向Pinostilbene可能通过一种不依赖于NCOA4-铁蛋白自噬的新途径促进FTH1降解。
3.5. Pinostilbene促进FTH1的K48-连接泛素化和蛋白酶体降解
为了验证FTH1降解的机制，研究使用了蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺进行追踪实验，发现Pinostilbene在RSL3存在时显著加速了FTH1蛋白的降解。进一步使用蛋白酶体抑制剂MG132和溶酶体抑制剂E64/Pepstatin发现，只有MG132能逆转Pinostilbene对FTH1的降解作用。免疫共沉淀实验证实，Pinostilbene显著增强了RSL3刺激下FTH1的多聚泛素化。通过使用不同赖氨酸残基突变的泛素质粒，研究人员最终确定K48是Pinostilbene介导FTH1泛素化连接和后续蛋白酶体降解的主要位点。
3.6. Pinostilbene通过激活STING/铁死亡通路在体内发挥抗肿瘤作用
在小鼠Lewis肺癌移植瘤模型中，Pinostilbene单药治疗能有效抑制肿瘤生长，且未对主要脏器造成明显病理损伤。从肿瘤组织中提取的蛋白质和mRNA分析证实，Pinostilbene在体内同样激活了STING/TBK1/IRF3通路及其下游细胞因子，并下调了FTH1蛋白水平，同时上调了铁死亡标志物4-HNE。免疫组织化学显示其能抑制肿瘤细胞增殖（Ki67表达下降）。此外，Pinostilbene上调了肿瘤组织中炎性细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）的表达，并增加了肿瘤杀伤性CD8+T细胞的浸润。
3.7. Pinostilbene增强铁死亡诱导剂RSL3的体内抗肿瘤功效
体内联合用药实验表明，Pinostilbene与RSL3联用比RSL3单药能更显著地抑制肿瘤生长，且未增加全身毒性。免疫组织化学分析显示，联合治疗组比RSL3单药组更能下调肿瘤组织中的FTH1蛋白、上调4-HNE水平并降低Ki67阳性细胞比例，证明了其在体内增强铁死亡和抑制增殖的协同作用。
3.8. Pinostilbene与RSL3联合促进LLC肿瘤内CD8+T细胞浸润、激活和巨噬细胞M1极化
通过对肿瘤免疫微环境的深入分析发现，Pinostilbene与RSL3的联合治疗显著增加了肿瘤内CD8+T细胞的比例，并提升了这些细胞中活化标志物（CD107a、CD25、IFN-γ）的表达，同时降低了耗竭标志物PD-1的表达。此外，联合治疗促进了肿瘤相关巨噬细胞向抗肿瘤的M1表型（CD86+）极化，而未显著改变中性粒细胞或巨噬细胞的总体比例。
讨论与结论
本研究首次将天然化合物Pinostilbene鉴定为一种有效的STING激动剂，并系统阐明了其通过一种全新机制增敏NSCLC细胞铁死亡的作用。其核心创新点在于发现Pinostilbene能绕过经典的NCOA4-铁蛋白自噬途径，通过促进FTH1发生K48-连接的泛素化修饰，并经由蛋白酶体途径将其降解。这一过程释放出储存的铁，增加了不稳定的铁池，从而为铁死亡的发生创造了关键条件。体内实验不仅验证了其单药及与RSL3联用的抗肿瘤效果和安全性，还揭示了其重塑肿瘤免疫微环境的能力，即通过激活STING通路和诱导铁死亡，协同促进CD8+T细胞的浸润与活化，并驱动巨噬细胞向M1型极化。
这项研究的重要意义在于多方面：首先，它为解决现有STING激动剂的临床转化难题（如细胞渗透性差、稳定性低）提供了一种具有更好生物利用度的天然候选分子。其次，它揭示了一条不依赖于铁蛋白自噬的、全新的FTH1蛋白降解调控通路，丰富了铁代谢和铁死亡调控的理论认知。最后，它证明了将STING通路激活、铁死亡诱导和免疫调节三者相结合的治疗策略在NSCLC中的可行性和高效性。Pinostilbene这种“一石三鸟”的作用机制——直接诱导癌细胞铁死亡、激活先天免疫STING通路、以及增强适应性抗肿瘤免疫应答——使其成为一个极具潜力的NSCLC治疗新选择，为开发基于铁死亡和免疫调节的联合疗法提供了新的思路和实验依据。
