《Sensors and Actuators B: Chemical》：AI-Assisted Smartphone Biosensor with Nanofibrous Membranes Platform for Highly Sensitive Multiplexed Vertical Flow Assays
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垂直流动分析平台通过复合纳米纤维膜提升生物分子固定效率并保持活性，结合金纳米颗粒标记和颜色传感器实现农药抗生素多路检测，检测限显著低于传统方法75.67%。
杨晓|李志辉|张乐茹|穆罕默德·阿瓦德·阿贝达尔瓦法|王富军|王璐|李艳
中国上海东华大学纺织学院，教育部纺织科学技术重点实验室，邮编201620
摘要
在用于即时检测（point-of-care testing）的垂直流分析（VFA）中，一个重要的挑战是在保持固定化生物分子生物活性的同时提高其固定化效果。为了解决这个问题，我们开发了一种高灵敏度的多重VFA平台，该平台以复合纳米纤维膜作为核心反应垫。这种膜是通过共电纺聚偏二氟乙烯（PVDF）和聚乙烯醇（PVA）制成，并随后用戊二醛交联而成，具有坚固的3D多孔结构。这种设计显著增强了链霉亲和素的固定效果，保持了其生物活性，并允许高效的垂直流体灌注，以最大化生物分子之间的相互作用。当与使用金纳米颗粒偶联物的比色适配体传感器结合使用时，该平台能够快速、现场、可视化地检测农药（氯吡硫磷和吡虫啉）和抗生素（氯霉素），检测限分别为0.158 ng/mL、2.433 ng/mL和0.05 ng/mL，比肉眼检测限低75.67%以上。灰度值（ΔG）是通过使用蒙特卡洛训练的卷积神经网络结合随机采样方法获得的。这项工作展示了在即时检测方面的重大进展，将高灵敏度转化为食品安全监测的实际应用。
引言
食品安全事件对全球公共卫生构成了持续且严重的风险，因此需要快速的现场诊断来防止大规模爆发[1]、[2]。作为回应，即时检测（POCT）作为一种关键策略应运而生，它能够在污染源（如现场、加工厂和市场）进行分散式检测，从而在关键控制点直接进行监测[3]、[4]、[5]、[6]。POCT的基本优势，包括低成本、操作简便以及对专业设备或培训人员的需求最小，已在该领域得到充分认可，并成为保障食品供应链安全的基础[7]、[8]。在各种POCT格式中，比色检测方法特别适合资源有限的环境。它们的主要优势是能够生成可视化的结果，支持立即干预和常规的大规模筛查，而无需依赖复杂的仪器[9]、[10]、[11]。
高性能比色POCT的发展与先进传感平台的发展密切相关[12]、[13]。电纺纳米纤维膜（NFMs）作为一种有前景的材料类别出现，具有较大的比表面积、可调节的孔隙率和可定制的表面化学性质，为化学检测提供了理想的基础[14]、[15]。早期的研究利用这些特性，将NFMs作为比色试剂的惰性基底，通过增强酶、抗体和适配体等生物识别元素的固定效果，实现了比传统滤纸更高的灵敏度[16]。后续研究将NFMs集成到商用侧向流分析（LFAs）中，例如，将它们纳入偶联垫中以控制试剂流动或将其放置在测试线上以增强信号生成[17]。然而，传统LFAs的一个根本局限性是它们无法充分利用NFMs的三维（3D）多孔结构。主要的切向流路径使样品仅在膜表面流动，而不是穿过其深度，限制了分析物与捕获剂之间的相互作用，从而限制了NFM平台本可以带来的灵敏度提升[18]、[19]。
这一困境增加了人们对垂直流分析（VFAs）作为有前景替代方案的兴趣[20]。与传统的侧向流系统不同，VFAs使样品垂直穿过堆叠的NFMs，自然地与NFMs的三维多孔网络对齐。这种三维（3D）几何结构增强了流体传输，并在整个膜厚度内实现更深、更均匀的分析物捕获。一个关键优势是在多重检测过程中减少了信号串扰，因为垂直分隔的测试区域防止了检测元素的横向混合，这是传统格式中的一个常见问题[21]。然而，这种架构也存在一个根本的权衡：快速流速虽然有利于快速获得结果，但会通过限制分析物与捕获剂之间的相互作用时间而降低灵敏度[21]。尽管高级修改（如光子晶体或工程化界面层）可以调节流速并提高灵敏度，但这些改进往往会损害POCT部署所需的简单性、可制造性和成本效益[22]、[23]。因此，这些关键属性的丧失成为资源有限环境中采用VFAs的重大障碍[24]、[25]。
为了在比色POCT中进行可靠的定量分析，基于智能手机的读数方法因它们的普及性和连接性而受到重视。传统方法依赖于直接分析RGB值、转换为灰度或HSV通道，或使用物理校准卡[26]、[27]、[28]。尽管这些方法易于实现，但它们经常容易受到环境光变化、相机传感器不一致性和背景干扰的影响，这会影响照片分辨率并限制其在现场环境中的重复性和可靠性[29]、[30]。为了缓解这些问题，人工智能（AI）和机器学习方法（包括用于图像标准化的卷积神经网络（CNNs）、用于分类的支持向量机（SVMs）以及用于浓度预测的回归算法越来越多地被集成到基于智能手机的检测平台中[31]、[32]、[33]。这些技术增强了对抗环境变量的鲁棒性，减少了照片中的噪声，并保持了高分辨率，从而降低了有效检测限。
基于上述内容，我们设计了一种由聚偏二氟乙烯（PVDF）和聚乙烯醇（PVA）组成的新型复合NFM作为垂直流适配体的核心反应垫。这种材料策略协同利用了结构和生物相容性的优势：PVDF/PVA NFM作为一个坚固的3D支架，为生物分子相互作用提供了比传统硝化纤维素膜大得多的表面积，从而实现了更高的适配体密度和更强的信号生成。同时，PVA的加入减轻了PVDF的固有疏水性，确保了快速且一致的垂直流体灌注，这是均匀检测动力学的前提。除了赋予亲水性外，PVA成分还形成了类似水凝胶的相，在纳米纤维基质内创建了一个稳定的、水合的微环境。这种微环境显著减少了溶剂蒸发，同时保持了固定化生物识别元素的构象完整性和生物活性。通过结合蒙特卡洛模拟训练的CNNs，生成了低噪声、高分辨率的图像，并进行了广泛的RGB值采样和解释，实现了高灵敏度的检测。将这种优化的NFM集成到垂直流配置中，得到了一个能够同时实现高灵敏度和实际实用性的适配体平台。由此产生的生物传感器能够快速、多重、可视化地检测低浓度的农药和抗生素，这对现场食品安全监测是一个重大进展。
材料
所有DNA寡核苷酸（表S1）[34]、[35]、[36]、生物素、Tris(2-羧乙基)膦（TCEP，99%）和链霉亲和素（SAV，56 kDa，98%）均从上海生物工程有限公司购买。Sigma-Aldrich提供了PVA（Mw=89,000）、PVDF（Mw=534,000）和4-羟基偶氮苯-20-羧酸（HABA，99.5%）。戊二醛（GA，50%水溶液）和二甲基亚砜（99.9%）从Adamas Reagent有限公司获得。BCA检测试剂盒（500次检测）来自上海胜工生物技术公司
VFA平台的NFMs制备
为了充分利用纳米纤维在VFA中的结构优势，我们设计了一种专用的基于纳米纤维的传感膜。该膜旨在满足VFA格式的三个关键要求（方案1）：高效固定生物识别元素（例如SAV）；足够的机械强度以承受夹紧和流体流动而不受损伤；以及在垂直灌注过程中有效拦截目标分子。为此，我们选择了PVDF作为主要材料
结论
本研究开发了一种使用共电纺PVDF和PVA制备的新型复合NFMs的高性能视觉VFA平台。随后用GA交联后，形成了一个多孔、亲水的三维网络，提高了链霉亲和素（SAV）的固定效率和生物活性，实现了高密度的生物素化适配体探针。当与夹心式比色适配体传感器结合使用时，该平台实现了灵敏、特异性和多重检测
CRediT作者贡献声明
李艳：监督、资源管理、项目协调、资金获取、数据管理、概念构思。王富军：监督、资源管理、资金获取。王璐：监督、资源管理、资金获取。张乐茹：可视化、方法学研究、实验实施。穆罕默德·阿瓦德·阿贝达尔瓦法：写作——审稿与编辑、验证、实验实施、资金获取、数据分析。杨晓：写作——初稿撰写、可视化、方法学研究、实验实施。李志辉：方法学研究
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了中央高校基本研究基金（项目编号：2232022G-01）、上海市科学技术发展基金会（21S31900700）以及学科创新海外专家引进项目（111项目2.0，项目编号BP0719035）的支持。
利益冲突声明
所有贡献作者均没有与本文讨论的主题或材料相关的财务利益、关系或隶属关系。杨晓先生毕业于中国上海的东华大学，获得学士学位（2023年）。他目前是上海东华大学纺织学院的博士生，他的研究方向是基于电纺纤维材料的结构设计及其表面功能的修改，用于生物医学应用。
