R2R 制造薄膜芯片上的牙周病原体检测：化学发光与电化学检测方法之比较

《Sensors and Actuators Reports》：Detection of periodontal pathogens on R2R fabricated foil-based chips - comparison of chemiluminescent and electrochemical detection

为解决牙周炎诊断对快速、灵敏POC（床旁诊断）工具的需求，本研究开发了一种基于R2R（卷对卷）制造技术的微流控芯片平台，用于酶促核酸检测。研究比较了化学发光（CL）和电化学（EC）两种检测方法，成功检测了总菌载（TGL）和五种关键牙周病原体的DNA标准品及大肠杆菌（E. coli）和中间普氏菌（Pi）细胞，证明了该芯片平台具有高灵敏度和重复性，为未来开发满足REASSURED标准的牙周病诊断设备奠定了基础。

　　

牙周炎是一种在全球范围内广泛流行的慢性炎症性疾病，它不仅会导致牙齿支持组织的进行性破坏和牙齿脱落，越来越多的证据还表明它与心血管疾病、糖尿病和不良妊娠结局等全身性疾病密切相关。因此，早期诊断和治疗变得至关重要。诊断牙周炎不仅需要识别特定的病原体，如中间普氏菌（Prevotella intermedia）、伴放线聚集杆菌（Aggregatibacter actinomycetemcomitans）、牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）、齿垢密螺旋体（Treponema denticola）和福赛斯坦纳菌（Tannerella forsythia），评估病灶处的总菌载（Total Germ Load, TGL）对于判断疾病严重程度和活动性也具有重要意义。然而，传统的检测方法如PCR（聚合酶链式反应）虽然灵敏，但往往耗时、需要昂贵设备、操作步骤繁琐，难以在牙科诊所或家庭环境中实现快速、便捷的床旁诊断（Point-of-Care, POC）。此外，在牙周治疗中滥用广谱抗生素会加剧细菌耐药性的发展，这进一步凸显了对能够指导靶向抗菌治疗的快速诊断工具的迫切需求。理想的POC诊断工具需要高度灵敏、特异、用户友好、快速、经济高效，并且能够将结果数字化以便长期治疗决策。为了应对这些挑战，生物传感器与微流控技术的结合展现出了巨大潜力。本研究正是在这一背景下展开，旨在开发一种新型的、可规模化生产的诊断平台。相关研究成果发表在《Sensors and Actuators Reports》期刊上。

本研究主要运用了以下几项关键技术方法：1. 微流控芯片设计与制造：采用卷对卷（Roll-to-Roll, R2R）紫外纳米压印光刻技术，在聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）薄膜上大规模制造了可折叠的微流控芯片（FoldChip），该设计包含进样口、检测通道（集成了电极结构）和废液腔。2. 检测方法比较：在同一个芯片平台上，平行实施了基于辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase, HRP）催化的化学发光（Chemiluminescent, CL）和电化学（Electrochemical, EC） 两种检测方法，直接比较了它们的性能。3. 样品前处理：采用了一种新型的、基于离子液体（Ionic Liquid, IL） 的裂解方案，可在室温下高效裂解细菌细胞，释放目标核糖体RNA（rRNA），省去了传统热裂解步骤。4. 核酸捕获与信号生成：在芯片的检测通道或工作电极（Working Electrode, WE）表面点样固定了病原体特异性的捕获DNA，通过与目标rRNA杂交、随后结合链霉亲和素-HRP（Streptavidin-HRP, STA-HRP）复合物及相应底物（CL用鲁米诺，EC用3,3′,5,5′-四甲基联苯胺，TMB）产生检测信号。

研究结果

3.1. 微流控尺寸对电化学传感器信号影响的研究

研究人员通过实验探究了微流控通道高度对EC检测信号的影响。实验表明，在高度小于100微米的微腔中，由于TMB_ox（氧化型TMB）的不可逆消耗，会出现显著的底物耗尽效应，导致信号快速衰减。增加通道高度可以缓解此问题。比较在工作电极（WE）表面修饰与在通道顶膜修饰两种方案后发现，在FoldChip的最终设计（通道高132.5微米）中，在WE上点样捕获DNA虽然会引入更高的电容性背景电流，但能获得相对于空白更高的信号和更好的线性度，因此后续实验均采用修饰WE的方案。ox的耗尽情况。 B) EC信号分析 (II) 在微流控腔室中使用修饰的WE，以及 (III) 在微流控腔室或微流控通道中使用修饰的流体顶膜。">

3.2. DNA标准品检测

研究使用总菌载（TGL）和五种牙周病原体的DNA标准品，在封闭式和开放式芯片上，对CL和EC检测方法进行了系统测试与表征。结果表明，芯片的制造工艺具有良好的重复性，并且功能化芯片在45°C下加速老化56天后仍表现出良好的储存稳定性。不同的芯片制备程序（是否进行封闭步骤）对分析性能（线性范围、饱和浓度和检测限）没有显著影响。CL和EC检测对DNA标准品均表现出0.01–25纳摩尔（nM）的动态范围。总体而言，CL检测显示出更高的灵敏度和重复性（检测限，LOD，范围为12–120皮摩尔，pM），而EC的LOD范围更宽（2皮摩尔–1.2纳摩尔）。其中，对TGL和牙龈卟啉单胞菌（Pg）的检测获得了最佳LOD值（TGL: CL 0.05 nM， EC 0.03 nM； Pg: CL 0.01 nM， EC 0.02 nM）。

3.3. 细胞检测

研究进一步评估了该平台对实际细菌细胞的检测能力。以大肠杆菌（E. coli）作为TGL参数，并以中间普氏菌（Pi）细胞为对象，应用IL裂解后进行rRNA分析。在跨批次生产的芯片上进行的E. coliCL检测显示了良好的重现性。对于两种细菌细胞的检测，EC和CL方法均能在较宽的浓度范围内工作。值得注意的是，EC检测显示出更高的灵敏度：对于E. coli，EC的LOD为3.44×10⁴细胞/微升，优于CL的9.7×10⁴细胞/微升；对于Pi，EC的LOD为5.6×10⁵细胞/微升，优于CL的1.03×10⁶细胞/微升。

结论与讨论

本研究成功开发、模拟并制造了用于CL和EC检测的FoldChip平台。通过DNA标准品检测，验证了该平台功能化芯片的稳健性、重复性和储存稳定性。对细菌细胞（E. coli和 Pi）的检测进一步证明了整个检测流程（从IL裂解到信号读出）的可靠性。尽管CL检测能提供稳健且可重复的信号，但EC检测凭借更低的检测限，展现了更优的分析灵敏度。

这项研究的意义在于，它不仅仅比较了两种检测方法，更关键的是将R2R规模化制造、室温IL裂解、以及灵敏的酶促核酸检测技术集成于一个微流控平台。EC检测方法因其易于实现小型化、数字化，且与REASSURED（实时连接、易于样本采集、负担得起、灵敏、特异、用户友好、快速、无需大型设备、可交付给终端用户）诊断标准高度契合，显示出开发未来真正满足床旁诊断需求的便携式设备的巨大潜力。本研究实现的灵敏度与之前使用注塑成型芯片分析临床样本的报告相当，尽管本研究因采用IL裂解而需要更高的样品稀释度。

当然，要充分发挥EC微流控检测系统的潜力，还需要在芯片设计和表面封闭等方面进行进一步优化。未来的发展方向包括利用印刷电子技术，在芯片卡平台上集成全印刷电化学系统，从而实现简单、经济、易获得的牙周炎诊断。此外，该EC和CL FoldChip平台连同IL裂解方法，仍需进一步的临床验证，以确定其在真实世界条件下的性能和适用性。总体而言，这项研究为开发下一代高性能、可负担的牙周病床旁分子诊断工具奠定了坚实的技术基础。