《SLAS Technology》：Viral vector research in human gene therapy: basic principles, alternative evaluation models, and clinical applications
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本文系统探讨了病毒载体在人类基因治疗中的核心作用，比较了其在不同替代评估模型（如斑马鱼、鸡胚绒毛尿囊膜、类器官等）与多种疾病（癌症、心血管病、神经疾病、骨科再生医学等）治疗应用中的疗效。文章重点阐述了逆转录/慢病毒(RV/LV)、腺病毒(AdV)、单纯疱疹病毒(HSV)和重组腺相关病毒(rAAV)等主要病毒载体的结构、生命周期、优劣势及改进方向，旨在通过理解病毒介导的基因递送机制来优化现有策略并推动临床转化。
2. 病毒载体作为基因递送系统
基因治疗通过载体将外源治疗性基因序列导入靶细胞，以修饰细胞功能。与非病毒载体相比，病毒载体因其更高的基因转移效率、更长的转基因表达水平、高效跨越细胞屏障以及保护转基因免受生物降解的能力而被广泛应用。目前应用最广泛的主要病毒载体包括逆转录病毒/慢病毒载体(RV, LV)、腺病毒载体(AdV)、单纯疱疹病毒载体(HSV) 和重组腺相关病毒载体(rAAV)。
这些载体的关键特征各有不同。RV/LV的优势在于能整合到宿主基因组中，实现长期的转基因表达（可达数年），且由于其DNA原病毒形式易于进行分子修饰。但其局限性包括转基因容量相对有限（7-12 kb），存在插入诱变风险，且主要靶向分裂细胞（LV除外，它可靶向分裂和非分裂细胞），以及在细胞筛选前的转导效率较低（< 20%）。AdV则拥有较大的转基因容量（可达35-37 kb），对多种组织靶标具有广泛的嗜性，并且转导效率高（可达100%）。然而，它具有免疫原性（存在针对AdV的预存抗体），且基于游离体的转基因表达时间较短（1-2周），第三代载体可延长至约5-6周。HSV能够靶向分裂和非分裂细胞，转基因容量巨大（35-150 kb），转导效率高（可达100%）。但第一代HSV具有免疫原性和细胞毒性，且转基因表达通常也较短（2-6周），使用新型载体和/或潜伏期启动子/绝缘子可使在神经系统中的表达延长至约1年。rAAV是目前临床应用广泛的一类载体，具有对多种组织的广泛嗜性，能靶向分裂和非分裂细胞，转导效率高（可达100%），且基于稳定游离体的转基因表达持久（数月至数年），毒性极低。其主要的局限性在于转基因容量有限（< 5 kb），以及可能存在的针对AAV衣壳蛋白的免疫反应。
通过这张图可以直观地比较不同病毒载体的结构组成和基因组类型。
该图形象地展示了不同病毒在靶细胞内的生命周期关键步骤，有助于理解其基因递送机制。
2.1. 逆转录病毒/慢病毒(RV/LV)
逆转录病毒是逆转录病毒科(Retroviridae)的小型RNA病毒，其基因组为RNA，经逆转录酶反转录为DNA后整合到宿主细胞基因组中形成原病毒。基于此特性开发的RV载体是基础生物学研究和转化研究中需要持久基因表达的重要工具，尤其适用于多种单基因疾病的治疗。但它们的免疫原性、插入诱变风险、仅靶向分裂细胞（LV除外）和低转导效率阻碍了其更广泛的临床应用。
2.2. 腺病毒(AdV)
腺病毒是一种无包膜病毒，具有二十面体蛋白衣壳和线性双链DNA基因组。多数人体内存在针对常见腺病毒血清型的中和抗体，这导致基于腺病毒的载体往往比其他病毒载体（如AAV）效果降低且引发更强的免疫反应。但AdV具有高转导效率、广泛的组织嗜性以及现成的规模化生产系统等优势。根据遗传修饰程度，复制缺陷型AdV可分为第一代、第二代和第三代（也称无肠、辅助依赖型或高容量AdV）。其中第三代AdV去除了除包装必需序列外的所有腺病毒DNA，可容纳更大的转基因盒，理论上免疫原性更低，转基因表达时间更长。
2.3. 单纯疱疹病毒(HSV)
HSV是一种有包膜的神经嗜性双链DNA病毒，具有大型基因组。由于其天然的神经嗜性和巨大的转基因容量，HSV载体已成为基因治疗中日益强大的平台。主要分为两类：一是通过删除必需IE基因构建的非复制型基因组HSV(nrHSV)；二是无病毒编码基因的辅助依赖性HSV扩增子，可递送高达~150 kb的转基因。这些载体利用了HSV生物学的固有优势，如高效进入外周感觉神经元、高效的逆行轴突运输以及建立类似潜伏状态的能力，支持持久表达而无插入诱变风险。
2.4. 重组腺相关病毒(rAAV)
rAAV是一种小的无包膜病毒，携带单链DNA基因组，属于细小病毒科(Parvoviridae)的依赖病毒属(Dependovirus)。rAAV载体可通过完全去除AAV编码序列，在两个反向末端重复序列(ITR)之间插入转基因盒来构建。rAAV体积小，能有效结合并穿透致密组织，且不同血清型在嗜性和基因转移效率上存在差异。它们能够高效靶向多种组织的分裂和非分裂细胞，并实现长期的转基因表达。限制其临床应用的主要挑战包括有限的转基因容量（< 5 kb）、单链基因组转化为双链DNA的速率限制步骤，以及针对AAV衣壳蛋白的潜在宿主免疫反应（人群中存在高比例的预存抗体）。
3. 病毒载体研究中的替代评估模型
病毒载体作为基因治疗研究的强大工具，为治疗多种人类疾病提供了有前景的途径。为了理解病毒载体在不同生物环境中的有效性和安全性，并减少对实验动物的依赖，多种替代评估模型被开发出来。本章节探讨了此类替代模型在病毒载体研究中的应用。
该图汇总了目前用于病毒载体研究的各种替代评估模型及其应用特点。
3.1. 斑马鱼(Danio rerio)
斑马鱼因其体型小、空间需求少、繁殖能力强、发育迅速以及与人约70%的蛋白编码基因具有同源性等优点，成为传统小鼠模型的替代选择。研究表明，斑马鱼胚胎颅内注射腺病毒能实现高效的基因转移和表达，支持了该模型作为腺病毒临床前早期评估工具的潜力。
3.2. 绒毛尿囊膜(CAM)
绒毛尿囊膜是禽类胚胎外膜，拥有密集的血管网络，被广泛用于肿瘤学、血管生成等研究的体内模型。研究利用CAM建立了肿瘤模型，用于研究肿瘤形成以及通过瘤内和静脉注射人腺病毒的靶向递送。这种模型方法简单、成本低，可同时测试多种实验条件。
3.3. 细胞和外植体培养系统
细胞和外植体培养系统是研究病毒载体行为、嗜性和治疗潜力的重要工具。特别是三维培养系统和外植体培养能更好地模拟体内细胞所处的微环境。例如，在三维聚集体培养中，使用AdV或rAAV载体递送转化生长因子β1(TGF-β1)、骨形态发生蛋白2(BMP-2)、胰岛素样生长因子I(IGF-I) 或软骨特异性Sox9转录因子(sox9) 基因，可有效诱导间充质基质细胞(MSCs)的软骨分化，增加细胞外基质(ECM)的产生，并减少肥大分化和骨化。在源自骨关节炎患者的软骨细胞或软骨外植体模型中，rAAV介导的sox9基因过表达也能显著促进ECM的合成，逆转OA表型。
图为鸡胚和鹌鹑胚的绒毛尿囊膜，展示了其血管网络形态。
该图展示了使用人关节软骨外植体模型评估rAAV基因递送效率的实验结果，证明了材料引导递送的优势。
3.4. 类器官
类器官是实验室培养的、能模拟原始组织结构、功能和基因表达的三维(3D)细胞结构。它们为研究疾病发展、器官形成以及评估基因疗法等提供了宝贵平台。类器官可源自组织特异性干细胞或诱导多能干细胞(iPSCs)。研究表明，在人iPSC衍生的脑类器官中，rAAV能有效进行基因转移，不同血清型（如rAAV5优于rAAV9）表现出不同的靶向和调控效率。同样，在iPSC衍生的视网膜类器官中，rAAV和AdV也能有效转导，某些变体（如rAAV2-7m8）和高容量AdV表现出优越性。iPSC衍生的肺类器官则被用作肺部疾病研究和治疗的平台。
3.5. 器官芯片
器官芯片是一种在微流控芯片上构建的、模拟人体器官微生理环境的系统。尽管成本较高且通量有限，但它能提供动态的微环境来研究细胞-细胞和细胞-基质相互作用。例如，在iPSC衍生的视网膜芯片上评估不同血清型的自互补AAV(scAAV)，发现scAAV2.7m8在多种视网膜细胞类型中的转导效率优于scAAV2和scShH10。黑色素瘤患者来源的器官型肿瘤球芯片(PDOTS)也被用于测试AdV介导的基因治疗疗效。
总之，这些替代评估模型（斑马鱼、CAM、细胞/外植体培养、类器官、器官芯片）各有优势，共同为病毒载体的临床前研究提供了多样化、更贴近人体生理的测试平台，有助于在减少动物使用的同时，更有效地优化载体设计和评估治疗策略，推动基因疗法向临床应用转化。
