新型活性位点靶向荧光探针，用于实时监测肿瘤细胞和组织中的CDK4/6蛋白

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Novel active site -targeted fluorescent probes for real-time monitoring of CDK4/6 in tumor cells and tissues

CDK4/6抑制剂Palbociclib结构导向开发了荧光探针Q1-Q9，Q2探针具有151±43 nM和193±70 nM的高亲和力，能实时动态成像CDK4/6，优于抗体染色，并保持抑制肿瘤细胞生长的生物活性，为乳腺癌诊疗提供新工具。

　　

高玉琪|齐世祥|董高攀|程明宇|刘文杰|陈海峰|王梦琪|秦蕾燕|王旭|张新欣|刘婷婷

山东省第一医科大学暨山东省医学科学院山东省癌症医院妇科肿瘤科，中国济南250117

摘要

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，而CDK4/6作为细胞周期依赖性激酶（CDK）家族的关键成员，已成为公认的治疗靶点。然而，能够在活细胞和组织中追踪这些激酶的小分子工具仍然十分匮乏。因此，我们以CDK4/6抑制剂帕博西利布的共晶结构为依据，进行了两轮优化，开发了一系列荧光探针（Q1-Q9），并对其选择性标记能力进行了筛选。对接实验和生化测定证实，这些新配体保留了帕博西利布的结合模式。其中，Q2对CDK4和CDK6表现出良好的亲和力（IC₅₀分别为151 ± 43 nM和193 ± 70 nM），并且能够在活细胞中提供更高分辨率的激酶图像，优于抗体染色。这种探针作为一种经济高效、稳定且易于使用的替代品，可以通过与活性化合物孵育后改变荧光信号来辅助药物初步筛选。重要的是，Q2仍具有生物活性，能够诱导细胞周期停滞并抑制肿瘤细胞生长，这与母体抑制剂帕博西利布的作用机制一致。因此，Q2是一种可用于实时可视化CDK4/6动态变化的化学工具，有望改善乳腺癌的诊断和治疗。

引言

乳腺癌是全球女性中最常见的恶性肿瘤，约占所有癌症病例的25%[1]、[2]、[3]。根据雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体2（HER2）的表达情况，乳腺癌可分为三种亚型：HER2阳性、激素受体（HR）阳性和三阴性亚型[4]。目前，内分泌疗法被认为是HR阳性乳腺癌患者的主要治疗手段，这类患者约占所有乳腺癌病例的60–70%[5]、[6]。然而，随着内分泌疗法的广泛使用，大量患者逐渐出现了耐药性问题[7]。先前的研究已经确定了内分泌耐药性的多种机制，包括内质网的丢失或突变、细胞周期信号分子的失调、内质网通路的改变以及多种逃逸通路的激活[8]、[9]。此外，由于缺乏ER、PR和HER2的表达，三阴性乳腺癌（TNBC）对内分泌疗法无反应[10]、[11]。因此，这些内分泌疗法的局限性促使研究人员寻找新的治疗靶点以克服耐药性并改善治疗效果[12]。 细胞周期依赖性激酶（CDK）家族是一类调控细胞周期转换和分裂的关键酶，使其成为乳腺癌治疗的潜在靶点[13]。作为CDK家族的成员，CDK4和CDK6是同源蛋白，它们的过表达与癌症发生密切相关[14]。在细胞周期从G1期向S期过渡的过程中，CDK4/6激酶会与细胞周期蛋白D结合。形成的细胞周期蛋白D-CDK4/6复合物会磷酸化视网膜母细胞瘤（RB）蛋白，并将其从E2F转录因子上解离，从而驱动细胞周期进展[15]。多种因素（如细胞周期蛋白D的过表达、CDK4/6负调节因子的丢失或突变以及CDK4/6的激活）会导致RB过度磷酸化，最终引发细胞增殖失控[16]。这些证据表明CDK4/6在癌症中起着关键作用，为抗癌治疗提供了理论基础。因此，实时监测活肿瘤细胞和组织切片中CDK4/6的表达水平和定位，以及追踪其活性，对于早期癌症诊断和治疗效果评估至关重要[17]。 近年来，基于小分子荧光探针的荧光成像技术已被广泛应用于活癌细胞中动态过程的可视化，具有高灵敏度、实时检测和非破坏性快速分析等优点[18]、[19]、[20]。由于小分子荧光探针的结构可修饰[21]、[22]、[23]，它们能够实时检测并成像细胞内的目标蛋白。通过将药效团与荧光团结合，荧光探针可以高效且特异性地传递到目标蛋白附近，实现高信噪比和出色的灵敏度。鉴于这些优势，且目前尚无针对CDK4/6的荧光探针，我们着手开发用于乳腺癌成像和治疗的荧光探针。 帕博西利布（Palbociclib）已被FDA批准用于ER阳性和HER2阴性的晚期乳腺癌联合治疗，因其良好的毒性和显著的临床疗效而被视为一种重要的治疗手段[24]、[25]。与其他已上市的CDK4/6抑制剂（如Trilaciclib、Abemaciclib和Ribociclib）相比，帕博西利布对CDK4和CDK6的选择性更强[26]。因此，我们选择帕博西利布作为设计针对CDK4/6的荧光探针的药效团。 根据帕博西利布与CDK6复合物的晶体结构（PDB: 5L2I，图S1），哌嗪环的NH基团位于溶剂区域，且帕博西利布的末端哌嗪部分可以通过特定角度轻松伸展进入溶剂[27]。因此，该位置是引入荧光团的理想修饰位点，不会干扰关键的结合相互作用。基于我们之前的经验[28]、[29]、[30]、[31]、[32]，我们尝试通过连接子将荧光团引入哌嗪环，从而获得一系列CDK4/6荧光探针。在探针设计中，我们考虑了不同的连接子和荧光团。最初，探针Q1-Q5使用丹磺酰氯作为荧光团，并系统地改变连接子长度。随后，选择对CDK4/6抑制活性最强的探针的连接子长度进行第二轮优化，生成了探针Q6-Q9，并进一步引入了具有不同荧光效果的荧光团。 CDK4/6蛋白与乳腺癌的发展密切相关，抑制它们可能成为有效的乳腺癌治疗手段[12]、[13]、[14]。因此，我们在乳腺癌细胞和组织中评估了这些针对CDK4/6的探针，以研究它们准确追踪CDK4/6和选择性标记肿瘤细胞和组织的能力，并探索其在CDK4/6抑制剂初步筛选中的潜力，这对乳腺癌的诊断和治疗具有重要意义。

试剂和设备

所有市售产品和试剂均按制造商说明直接使用或按说明使用。所有化合物的¹H NMR和¹³C NMR数据均在Bruker 400 MHz NMR光谱仪上记录，TMS作为化学位移的内标。HRMS（ESI）谱图由Thermo Fisher Q Exactive HRMS测定。探针的紫外吸收光谱和荧光光谱分别由UV-3600Plus紫外分光光度计和Hitachi 7100测量。

探针的对接研究

根据帕博西利布与CDK6的结合模式和共晶结构，哌嗪环上的NH基团是引入荧光团的理想位置。基于这一发现，我们设计了荧光探针Q1-Q9，通过改变连接子长度和结合不同的荧光团来实现（图1A）。 为了验证设计策略，我们对探针与CDK6蛋白的对接进行了研究。结果表明（图S2），...

结论

总之，我们合理设计了一系列小分子荧光探针（Q1-Q9），这些探针保留了帕博西利布的结合模式，并具有优良的光物理特性，能够直接可视化乳腺癌细胞和组织切片中的CDK4/6。其中，Q2不仅对CDK4和CDK6表现出良好的亲和力，还在肿瘤细胞和组织中具有出色的成像效果。

作者声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了山东省自然科学基金（项目编号：ZR2025MS1317、ZR2020QH344）、山东省中医药科学技术项目（项目编号：M20244703）、山东省医疗卫生科学技术项目（项目编号：202513031334）、泰安市科技创新发展项目（项目编号：2024NS159）、国家自然科学基金（项目编号：82104123）以及山东省第一医科大学人才引进基金的支持。