《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Determination of blood origin using flexible graphene/ag/SEBS substrate combined with surface enhanced Raman spectroscopy
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非破坏性血液物种检测中，柔性石墨烯/银/SEBS SERS基底通过0.34 nm单层石墨烯隔离金属与血液，解决了传统SERS的金属-生物分子直接接触问题，实现了98.54%的物种分类准确率，兼具高灵敏度（4-MBA检测限10?12 M）、超30天存储稳定性和百次折叠耐久性。
Jiansheng Chen|Jiaojiao Sun|Zhiqiang Zhang|Yubing Tian|Xianli Tian|Ce Wang|Xiaodong Wu|Peng Wang|Jing Gao
中国科学技术大学生物医学工程学院（苏州校区），生命科学与医学系，合肥230026，中国
摘要
血液种类的鉴定在法医调查中至关重要。表面增强拉曼散射（SERS）技术具有快速检测、非破坏性分析和高灵敏度等优势，但直接金属-生物分子相互作用可能导致光谱干扰和样品降解等挑战。本文提出了一种使用石墨烯/银/苯乙烯-乙烯-丁烯-苯乙烯（SEBS）柔性SERS基底的新型方法，以实现快速且非破坏性的血液种类鉴定。这种创新的“三明治”结构将单层石墨烯（0.34纳米）置于银纳米颗粒和血液样本之间，有效防止了金属与血液的直接接触，同时保持了优异的SERS增强效果。该柔性基底表现出良好的性能：高检测灵敏度（4-巯基苯甲酸（4-MBA）的检测灵敏度达到10^-12 M）、优异的储存稳定性（>30天）以及出色的机械耐久性（>100次折叠循环）。我们收集了五种动物物种的682个SERS光谱，并采用卷积神经网络算法进行分类，取得了98.54%的准确率、98.29%的精确度和98.38%的召回率。这种柔性基底能够实现快速分析，并且可以保持存档样本的光谱完整性长达31天。这种石墨烯/银/SEBS平台具有可靠的能力，为现场法医应用提供了准确的新手段：非破坏性分析、便携性、快速结果和高精度。
引言
血液在刑事调查中作为重要的物证，识别其种类可以为破案提供有价值的线索。在犯罪现场的应用包括：通过血液识别分析暴力行为和环境背景，判断是家养宠物还是野生动物，以及确定是否为非法狩猎或虐待动物。非破坏性的现场血液分析不仅能够保存样本，还能通过快速识别种类来加速和优化调查结果，同时保持证据的完整性[1]、[2]、[3]。因此，开发有效的现场非破坏性血液检测技术具有重要意义。
传统的血液种类鉴定方法主要包括鲁米诺技术、脱氧核糖核酸（DNA）检测和蛋白质测定。虽然基于DNA的方法（如测序和聚合酶链反应（PCR）具有高特异性，但它们对于紧急的现场应用来说耗时过长[4]、[5]。蛋白质测定方法（包括抗人血红蛋白胶体金测定、抗人转铁蛋白胶体金测定和酶联免疫吸附测定（ELISA）在实验室环境中具有高准确性，但在现场应用中存在许多限制[6]、[7]。例如，DNA检测通常需要很长时间，在紧急情况下难以快速进行。鲁米诺检测基于与血红蛋白的化学反应来显示血液痕迹[8]、[9]，但其特异性较低且容易受到环境干扰。这些限制阻碍了在犯罪现场进行快速、准确的血液种类鉴定。
相比之下，拉曼光谱技术最近作为一种非破坏性、快速且高度敏感的血液分析方法而出现[10]、[11]、[12]、[13]、[14]、[15]、[16]、[17]、[18]。与现有的法医方法相比，该方法具有与DNA分析相当的痕量检测灵敏度，检测速度更快，成本显著更低。同时，其检测准确率远高于免疫色谱法，尽管速度略慢于免疫色谱法。其核心优势在于能够在接近现场筛查的效率下实现实验室级别的微量化学物质精确鉴定。例如，D. Wael等人（2008年）准备了三种血液样本（人、猫和狗）以及一个红色模拟样本，并利用血红蛋白的拉曼峰成功识别了模拟样本中的血液[14]。I. K. Lednev的研究小组（2009年）结合主成分分析（PCA）方法，利用拉曼光谱有效区分了人血和动物血（狗血和猫血），识别率为99%[15]。在另一项研究中，研究人员使用偏最小二乘法对十二种不同物种的血液斑点进行了分类，在模型训练期间排除了牛的血谱，实现了100%的区分率[16]。J Fujihara等人（2017年）使用便携式拉曼光谱仪识别了11种血液斑点（人、鼠、兔、牛、马、羊、猪、猫、狗和鸡），他们在纱布上滴血形成血液斑点，48小时内测试光谱并使用PCA方法进行分析，识别率为100%[17]。最近，Gao Jing的研究小组（2019年）采用532纳米激发和深度学习技术对二十种物种进行了分类，包括人类，真空包装样本的准确率为97.33%[18]。然而，传统的拉曼光谱技术产生的信号较弱，需要高浓度分析物、强激发和长时间采集，这些条件通常不适用于痕量级别的快速现场检测。
表面增强拉曼散射（SERS）技术可以通过等离子体纳米材料增强拉曼散射信号，有效克服了传统拉曼光谱灵敏度低的限制[19]、[20]、[21]、[22]、[23]、[24]、[25]。SERS的核心原理是利用贵金属纳米结构的局部表面等离子体共振效应在“热点”处产生巨大的电磁场放大，从而将位于这些点的分子的拉曼散射信号增强几个数量级。W. R. Premasiri等人（2012年）使用SERS技术测试了人全血、血浆和红细胞的光谱[23]。O. K. Gasymov等人（2017年）在ZnO表面进行了全血实验，信号增强了20到30倍。他们指出，在ZnO表面进行的全血SERS实验为诊断人类疾病提供了有益的工具[25]。Ziegler等人使用SERS方法高效检测血液中的物质并研究了物种鉴定[26]、[27]。然而，传统的SERS基底均匀性和重复性较差。为了克服这些限制，已经开发了在聚合物薄膜或纸上制备的具有高灵敏度的柔性SERS基底[28]、[29]。尽管银的SERS活性比其他纳米材料（如金、铜、半导体和聚合物）更强，但传统的银基薄膜容易氧化、污染以及直接金属-血液相互作用，这些都会扭曲光谱并影响稳定性。
为了克服这些缺点，Li Jianfeng的研究小组在2010年引入了壳隔离纳米粒子增强拉曼光谱（SHINERS）技术，将金属核心封装在惰性的SiO2壳中（2-5纳米），显著提高了它们的化学稳定性和使用寿命，且不会发生电荷转移[30]、[31]。这种方法也不会改变分子的电子结构和光催化反应，其独特的隔离方式成功克服了SERS技术的缺点。近年来，这种方法已在许多领域得到应用[32]、[33]、[34]、[35]。尽管如此，SHINERS组装体通常表现出壳层厚度不均匀和针孔问题，尤其是在2纳米以下时，这限制了进一步的拉曼信号增强。
为了克服这些挑战，开发了一种具有“三明治结构”的新型柔性SERS薄膜，其中单层石墨烯（0.34纳米厚）将血液样本与银纳米颗粒隔开，防止直接金属-血液接触[36]。单层石墨烯的厚度远小于传统SHINERS结构的壳层厚度（2-5纳米），显著增强了拉曼信号的输出强度。此外，石墨烯具有荧光淬灭效应，可以防止纳米颗粒氧化，从而在一定程度上提高SERS基底的稳定性和重复性，并避免光诱导的损伤[37]、[38]、[39]。在本实验中，银纳米颗粒被固定在柔性SEBS薄膜上，确保与样本的紧密接触。使用这种“三明治”SERS基底，我们收集了五种物种的SERS光谱并通过卷积神经网络进行分类，准确率达到98.54%。该平台为犯罪现场的血液种类鉴定提供了一种快速、灵敏且可重复的方法，具有重要的法医应用潜力。
实验部分
2.1. 材料。硝酸银（AgNO3）、柠檬酸三钠、六水合氯化铁（FeCl3·6H2O）、聚乙烯亚胺（PEI，分子量70,000，30%）、氢氧化钠（NaOH）、丙酮、乙醇和环己烷均购自上海Aladdin BioChem Technology Co., Ltd.（中国）。弹性体聚（苯乙烯-乙烯-丁烯-苯乙烯）（SEBS）由Sigma Aldrich提供。铜箔上的聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）包覆石墨烯单层（PMMA/Graphene/Cu）由苏州Tanfeng提供。
结果与讨论
3.1. 柔性基底的表征。SEBS基柔性AgNPs/Graphene SERS膜的制备过程如图1a所示。从图1a-c中的扫描电子显微镜（SEM）图像可以看出，Ag纳米颗粒在SEBS表面密集且均匀分布，形成连续的等离子体层，而转移的单层石墨烯膜则贴合在Ag纳米颗粒阵列上，没有明显的裂纹或分层现象。这种分层结构保持了丰富的...
结论
本研究成功开发了一种新型的石墨烯/Ag/SEBS柔性SERS基底，用于快速血液种类鉴定。关键创新在于超薄石墨烯屏障（0.34纳米），它防止了金属与血液的直接接触，同时保持了比传统SERS方法更优异的SERS增强效果。该基底表现出出色的性能：高检测灵敏度、优异的储存稳定性和出色的机械耐久性。使用682个SERS光谱...
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系，这些关系可能会影响本文报告的工作。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（项目编号42407586、62075234、82527806）、江苏省“333”计划（项目编号20243-0930）以及中国科学院重大科学仪器设备研制项目（项目编号ZDKYYQ20200004）的资助。
