《Surface and Coatings Technology》：Biofunctional glass chamber slides: Plasma coatings enable long-term reagent-free covalent functionalisation with diverse biomolecules
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在玻璃腔室片表面通过等离子体激活涂层（PAC）结合法拉第笼技术，成功共价固定细胞外基质（ECM）成分（含大分子结构蛋白和小信号蛋白及首次结合的高负电荷糖胺聚糖），解决了传统方法纳米颗粒污染和电荷排斥问题，涂层稳定性达5个月，适用于高分辨率显微成像的干细胞培养和空间模式化实验。
Xuege Feng|Jameel Sardharwalla|Aaron D. Gilmour|Syamak Farajikhah|Fariba Dehghani|Stuart T. Fraser|Marcela M.M. Bilek|Clara T.H. Tran
悉尼大学生物医学工程学院，新南威尔士州，2008年，澳大利亚
摘要 迫切需要改进体外（“在玻璃上”或培养皿中）的疾病细胞培养模型。开发新的疾病模型时，一个重大障碍是实现基底与活细胞之间的有效界面。塑料和玻璃因其提供实用的结构支撑和适合成像的光学特性而被广泛用于细胞培养，但生物学并未与这些基底共同进化，因此细胞对它们的反应不自然。特别是，重现包围和支持体内许多细胞类型的细胞外基质（ECM）极具挑战性。培养皿结合了玻璃的光学透明度和多孔培养格式的灵活性，使其在细胞成像中不可或缺。然而，未经处理的玻璃表面存在蛋白质的非特异性吸附、许多碳水化合物的附着不良以及细胞相互作用不佳的问题。
在这里，我们提出了一种简单且可扩展的等离子体激活涂层（PAC）方法，该方法通过精细的法拉第笼进一步增强，可以直接将商业可用的玻璃培养皿与ECM成分（包括小信号蛋白、大结构蛋白以及首次使用的高度负电荷糖胺聚糖）共价功能化，而无需使用连接剂化学物质或表面硅烷化处理。表面表征证实，PAC涂层对光学特性影响很小，且没有显著的纳米颗粒污染。经过PAC处理的培养皿在室温下储存5个月后仍保持强烈的生物分子反应性，这突显了该方法的稳健性和储存稳定性。这项技术为快速可靠地用ECM成分对玻璃基底进行表面功能化提供了一个模块化平台，使得重现体内细胞环境成为可能。PAC处理的培养皿非常适合干细胞培养中的生物界面工程、空间模式化实验和定制的多孔应用，为开发与高分辨率显微镜兼容的下一代体外细胞培养系统提供了一种简单的方法。
引言 在动物的组织和器官中，细胞存在于一个称为细胞外基质（ECM）的三维非细胞支持网络中[1] [2]。ECM是一个动态的、水合的、生物活性的网状结构，不断重塑，整合了生化和生物力学信号来调节细胞黏附、力学、运输、扩散和信号传导，从而驱动组织和器官的特异性结构和功能[3] [4] [5] [6]。虽然不同组织的ECM成分各不相同，但通常由结构蛋白（如胶原蛋白和层粘连蛋白异构体）和粘附性糖蛋白（如纤维连接蛋白和玻璃连接蛋白）组成，这些成分组织在蛋白聚糖和糖胺聚糖（GAGs）的水合基质中。高度阴离子化的GAGs（如硫酸软骨素）有助于保持水分并调节生物分子的结合和信号传导[1] [2] [7] [8] [9]。GAGs是由重复的二糖单元构成的长链无分支多糖。例如，硫酸软骨素（CS：在软骨和其他结缔组织如关节中丰富）、硫酸皮肤素（DS：在皮肤中常见）和透明质酸（HA：广泛分布于全身，是细胞外基质的主要成分）。硫酸软骨素和硫酸皮肤素上的硫酸基（和羧基）带有负电荷，吸引反离子并产生渗透压膨胀，从而增加富含GAG的网状结构的水合度[10] [11]。
目前还没有能够再现ECM复杂性的细胞培养涂层或表面。虽然有涂有胶原蛋白、纤维连接蛋白、玻璃连接蛋白和层粘连蛋白的细胞培养表面，但由于成本问题，尤其是在资金有限的科研实验室中，这些技术的应用受到限制。此外，这些表面只涂有一种类型的生物分子（例如IV型胶原蛋白）。此外，市面上也没有用于细胞培养的GAG涂层表面。这主要是由于GAGs的负电荷，当它们被涂在经过负电荷氧等离子体处理的聚苯乙烯或玻璃上时，会导致排斥作用，从而阻止物理接触和固定。
作为一个多学科团队，我们专注于生成能够有效模拟ECM作为支持性细胞微环境的体外细胞培养表面。为了促进研究人员的广泛采用，这些细胞培养表面必须可调，以允许ECM中的多种不同生物分子与其结合。共价键合是最优选择，因为这样可以防止细胞培养过程中ECM成分的位移。这些表面还应具有出色的光学特性，因为高分辨率显微成像系统通常是生物学研究中的首选读出系统。虽然聚苯乙烯是最常见的细胞培养基底，但玻璃具有更优的光学特性。在生理pH值下，硼硅酸盐玻璃由于硅醇基团的脱质子化而呈现净负电荷[12]，这给负电荷ECM成分（如GAGs）的附着带来了问题。此外，尽管在玻璃盖片上进行细胞培养可以提供出色的光学特性，但需要繁琐的处理步骤（如转移、倒置或后固定安装），增加了污染、样品丢失或变形的风险[13] [14]。
培养皿将玻璃盖片与多孔腔室结合在一起，提供了实用的分区细胞培养格式。培养后，可以移除腔室，仅留下细胞在玻璃盖片上进行高分辨率显微分析。典型的培养皿由玻璃盖片、防水垫圈和聚合物腔室组成，可以在各个腔室中同时进行实验，并空间分辨地观察细胞行为、蛋白质定位或细胞分化模式。这种格式特别适用于干细胞生物学[15]、药物筛选[16]和遗传毒理学[17] [18]应用。培养皿允许局部接种细胞、在不同腔室中进行差异处理以及直接成像，无需转移细胞，从而减少变异性并保持培养的完整性。
等离子体激活涂层（PAC）已成为创建共价功能化细胞培养表面的有效技术。PAC是通过使用活性气体混合物的等离子体增强化学气相沉积（PECVD）生成的。在沉积过程中，基底表面形成一层纳米级的薄膜，其中嵌入了持久的活性自由基。这些自由基允许直接、无需试剂地共价固定蛋白质和其他生物分子[19] [20] [21]。等离子体激活涂层（PAC）可以沉积在硼硅酸盐盖片表面，与未经处理的盖片相比，显著提高了胚胎干细胞的体外分化效果[22]。与传统的表面功能化方法（如硅烷化）相比，PAC处理的表面具有更好的稳定性和可调的表面电荷。PAC处理的表面在涂层亚表面嵌入了长寿命的自由基。等离子体产生的自由基迁移到表面，并在那里与放置的生物分子共价结合[23] [24]。
将PAC技术扩展到复杂的三维结构带来了新的挑战。培养皿由集成在单个玻璃盖片上的多个腔室组成，这种结构在沉积过程中会产生半封闭的等离子体区域。这些结构会干扰建立电场的等离子体鞘，从而影响离子的加速和等离子体尘埃的悬浮。腔室培养耗材的独特几何形状会将尘埃或等离子体聚合的纳米颗粒聚焦到腔室内[25]。这些纳米颗粒随后在腔室内积累并附着在玻璃基底上，破坏了PAC薄膜的物理和化学均匀性[26]。它们的存在会降低光学透明度，产生成像伪影，并干扰生物分子固定的表面自由基的可用性。与带偏压的样品架电连接的细导电网可以重新配置局部等离子体电位[27] [28] [29]，并重新塑造等离子体鞘，使带电纳米颗粒在网状表面上静电悬浮，防止它们进入腔室并被气流带走[30]。
本工作的目标是创建功能稳定的PAC涂层表面，模拟ECM，具有简便的共价生物分子固定能力和出色的光学特性。还评估了PAC的生物分子结合能力的保质期，这是广泛采用的关键因素。最终，我们旨在开发下一代ECM模拟细胞培养系统，以开发更具生物学意义和成本效益的疾病体外模型。
部分摘录 培养皿的等离子体处理 使用定制的等离子体腔室系统和之前建立的玻璃上PAC沉积方法[22]，对苏打石灰玻璃培养皿（Millicell? EZ Slide，Merck，PEZGS0816，如图1A所示）进行了PAC沉积，并对其进行了修改以适应多孔培养板几何形状[30]。培养皿被放置在法拉第笼架中，以防止纳米颗粒沉积在腔室内。法拉第笼（图1）由铝制底座和顶部组成
等离子体处理的修改和纳米颗粒沉积的检测 为了评估等离子体处理过程中的纳米颗粒污染情况，使用明场显微镜和扫描电子显微镜（SEM）检测了有无法拉第笼处理的培养皿。如图2A所示，未经法拉第笼处理的培养皿内腔表面出现了明显的黄色色调，而光学显微镜显示有密集的纳米颗粒积累。相比之下，经过法拉第笼处理的培养皿没有检测到纳米颗粒沉积。
结论 在这项研究中，开发了一种借助法拉第笼的等离子体工艺，能够在基于玻璃的培养皿上产生稳定的PAC，长期保持单个ECM成分的表面反应性。该方法能够在复杂的腔室几何形状上形成均匀的纳米级薄膜，并证明了多种生物分子的强共价固定效果，范围从大型ECM蛋白和GAGs到小信号蛋白。五个月的长期储存测试证实了
CRediT作者贡献声明 Xuege Feng： 撰写——原始草稿、可视化、验证、方法学、研究、正式分析。Jameel Sardharwalla： 验证、方法学、研究。Aaron D. Gilmour： 撰写——审阅与编辑、验证、方法学、研究。Syamak Farajikhah： 资源提供。Fariba Dehghani： 资源提供。Stuart T. Fraser： 撰写——审阅与编辑、监督、项目管理、方法学、概念构思。Marcela M.M. Bilek： 撰写——审阅与编辑、监督、项目管理
写作过程中生成式AI和AI辅助技术的声明 作者确认手稿中出现的所有图像/艺术作品/照片（包括目录图形）都是原创的，由本手稿的作者创建/拍摄。在准备这项工作时，作者使用了ChatGPT（OpenAI，旧金山，美国）来提高手稿文本的清晰度和语法。使用该工具后，作者根据需要审查和编辑了内容，并对发表文章的内容负全责。
资金来源 该项目由悉尼大学 DVCR战略研究影响基金（DVCR POC 29-2024）和澳大利亚研究委员会 （ARC）（FL190100216）资助。
利益冲突声明 作者声明没有可能影响本手稿所述工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢 作者感谢Junyi Silas Qian在测量水接触角方面的帮助。我们还要感谢澳大利亚研究委员会（ARC）和悉尼大学的概念验证基金（PoC）在样品架修改方面的协助，以及悉尼显微镜和微分析中心以及悉尼分析中心在技术支持和仪器使用方面的支持。图形摘要是用
Biorender.com 创建的。
