《Talanta》：Assessment of sample preparation for single particle ICP-MS determination of mercury selenide nanoparticles in fish tissues within mercury speciation framework
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本研究致力于解决汞形态分析中新兴的硒化汞纳米颗粒（HgSeNPs）定量难题。研究人员评估了以氢氧化四甲基铵为提取剂的微波与超声辅助碱性提取方案，用于从鱼类组织中同时提取传统汞形态与HgSeNPs。结果发现，超声辅助提取能定量回收并保持HgSeNPs的粒径，而微波辅助提取则更适用于集成形态分析工作流程。该研究为全面理解汞的毒性及水生生物解毒机制提供了关键的样品前处理方法，并强调了开发相关认证标准物质的迫切性。
汞（Hg）是联合国世界卫生组织认定的十大主要危害化学品之一，其神经毒性、全球迁移性和在食物链中的生物富集能力，尤其是在水产品中，对人类健康构成重大威胁。然而，汞的毒性与其存在的化学形态密切相关。长期以来，科学家们关注的主要是元素汞、无机汞和剧毒的一甲基汞（MeHg）。近年来，随着研究的深入，一个新的“角色”进入了人们的视野——硒化汞纳米颗粒（HgSeNPs）。这些微小的颗粒并非偶然产物，而是生物体，特别是鱼类等水生生物，为了对抗汞毒性而形成的一种特殊“解毒产物”。研究表明，一甲基汞在生物体内可以发生去甲基化，并与另一种元素硒（Se）结合，最终形成稳定的HgSeNPs，从而降低汞的生物可利用性和毒性。因此，将HgSeNPs纳入完整的汞形态分析框架，对于准确评估汞的环境行为和生物毒性至关重要。
为了捕捉和分析这些“纳米级”的解毒产物，科学家们找到了一个强大的工具——单颗粒电感耦合等离子体质谱（spICP-MS）。这项技术能够逐个检测和分析溶液中的纳米颗粒，提供颗粒的数量浓度、质量，并在一定假设下计算其等效粒径分布。但问题来了：spICP-MS只能分析液态样品，而鱼类组织是固体。如何在不破坏这些娇嫩的纳米颗粒原始形态（如大小、聚集状态）的前提下，将它们完整、高效地从复杂的生物组织中“解放”出来，成为摆在研究人员面前的一道关键难题。现有的方法，如酶解法，往往耗时漫长；而甲酸提取法则可能不够温和。能否找到一种既高效、快速，又能兼容传统汞形态分析的统一提取方案？
发表在分析化学领域知名期刊《Talanta》上的一篇研究，正是为了回答这些问题。来自西班牙卡斯蒂利亚-拉曼恰大学的研究团队Marta Hernández-Postigo、Armando Sánchez-Cachero、María Jiménez-Moreno、ángel Ríos和Rosa Carmen Rodríguez Martín-Doimeadios开展了一项系统性的工作。他们提出，可以尝试使用在传统汞形态分析中常用的碱性试剂——氢氧化四甲基铵（TMAH）作为提取剂，并分别结合两种外加强能源：微波和超声波，来探索从鱼类组织中同时提取传统汞形态（如总汞、总硒、一甲基汞）和HgSeNPs的可能性。
本研究采用了多种关键技术与方法。样品前处理方面，系统评估了微波辅助提取（测试了80°C、150°C、180°C三种程序）和超声辅助提取（优化了时间、功率、振幅等参数）两种碱性（TMAH）提取方案。分析检测技术核心包括：使用单颗粒电感耦合等离子体质谱（spICP-MS）对HgSeNPs进行计数与粒径表征；使用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）测定总汞和总硒含量；使用气相色谱-热解-原子荧光检测联用仪（GC-pyro-AFS）进行传统汞形态（如一甲基汞）分析。由于缺乏HgSeNPs的认证标准物质，研究使用商业HgSe材料进行方法优化与性能评估。实际应用样本包括从当地超市购买的金枪鱼、剑鱼、三文鱼和蓝鳕鱼的肌肉组织，以及用于方法验证的认证参考物质DORM-2和DOLT-3。
3.1. 商业HgSe的表征
由于缺乏HgSeNPs的（认证）参考物质或标准品，研究首先使用市售的HgSe材料（含有纳米颗粒部分）进行方法优化。通过透射电子显微镜、能量色散X射线光谱、动态光散射和spICP-MS等多种技术对该材料进行了全面表征。结果显示，该材料由纯的Hg和Se组成，具有多边形形貌，粒径分布广泛，呈现出明显的多分散性。这为后续提取方法的优化提供了可靠的模型物质基础。
3.2. 微波辅助碱性提取的优化
研究人员测试了三种不同最高辐照温度的微波程序（80°C、150°C、180°C）。结果显示，在150°C下进行微波辅助提取，能够在保持HgSeNPs粒径不变的同时，获得最高的颗粒数量浓度。80°C的程序回收不足，而180°C的程序则可能导致部分纳米颗粒溶解，表现为离子背景信号显著升高。因此，150°C被选为后续研究的优化微波条件。
3.3. 超声辅助碱性提取的优化
超声参数（时间、功率、振幅）被系统优化。最终确定的最佳条件为：超声时间1分钟，功率28 W，振幅设定为2×10%。在此条件下，能从商业HgSe材料中提取出最高的HgSeNPs数量浓度，且不会引起粒径的显著变化。过短的时间或过低的能量输入不足以有效提取，而过长的处理或过高的能量则可能导致颗粒部分溶解或转化。
3.4. HgSeNP提取程序的分析性能
两种提取方法均表现出良好的分析性能，精密度（相对标准偏差）均低于5%。超声辅助提取在精密度和扩展测量不确定度方面均优于微波辅助提取。加标回收实验进一步验证了方法的准确性。在鲑鱼和蓝鳕鱼肌肉组织中添加商业HgSe材料，两种提取方法均获得了接近100%的回收率，且颗粒粒径得到保持，证明了方法在实际生物基质中的可靠性。
3.5. 在鱼类组织样品中的应用
将优化后的方法应用于剑鱼和金枪鱼肌肉组织。一个关键发现是，spICP-MS数据处理中统计方法的选择至关重要。对于背景信号较高的复杂样品，基于高斯分布的阈值设定比基于泊松分布的更能减少假阳性，提供更可靠的颗粒浓度和粒径结果。在两种鱼组织中，超声辅助提取获得的HgSeNPs数量浓度比微波辅助提取高出一个数量级，而两种方法得到的等效粒径（平均约400纳米）没有统计学差异。这表明超声辅助提取在定量回收纳米颗粒方面更具优势，而微波提取可用于筛查目的。
3.6. 综合汞形态分析方法的评估
研究评估了两种提取方案用于从单次提取中同时测定总汞、总硒、一甲基汞和HgSeNPs的可行性。结果表明，微波辅助提取（150°C）能够准确定量总汞、总硒和一甲基汞（在DORM-2和DOLT-3认证参考物质中得到验证），但其对HgSeNPs的回收率较低。相反，超声辅助提取能高效、定量地回收HgSeNPs，但其对总汞、总硒和一甲基汞的提取效率较低，未能实现定量回收。这凸显了两种方法的互补性：微波辅助提取适用于追求传统形态分析准确性的集成工作流程；而超声辅助提取则更专注于HgSeNPs的分离与表征。
研究的结论与讨论部分强调了这项工作的重要意义。它系统评估并比较了用于从鱼类组织中提取HgSeNPs的碱性提取策略。超声辅助碱性提取被证明是定量分离和表征HgSeNPs的优选方法，能在保持颗粒完整性的前提下实现高效回收。微波辅助碱性提取则更适合于综合性的汞形态分析工作流程，能够从同一样品提取物中可靠地测定总汞、总硒和一甲基汞，尽管其对HgSeNPs的定量回收能力有限。
这项研究将HgSeNPs这一新兴形态正式纳入了汞的形态分析框架，为更全面、更准确地评估汞的环境归趋、生物转化和毒性效应提供了关键的方法学支持。它揭示了不同样品前处理方法对纳米颗粒分析结果的巨大影响，强调了“对症下药”——根据具体分析目标选择合适提取策略的重要性。同时，研究结果也明确指出了当前领域的短板：缺乏HgSeNPs的认证标准物质，这阻碍了方法的完全验证和实验室间的可比性。未来，开发能够同时定量回收分子态和颗粒态汞物种的提取协议、建立稳健的spICP-MS数据处理标准、以及推动相关认证参考物质的研制，将是巩固spICP-MS在环境和生物分析化学中核心地位的关键。这项研究不仅为汞的生物地球化学循环和毒理学研究提供了有力的工具，也为其他金属纳米颗粒在复杂基质中的分析提供了可借鉴的思路。
