IP3R1 调节 AMPK-mTOR 介导的线粒体功能，从而影响猪卵子向胚胎的转变过程

《Theriogenology》：IP3R1 regulates AMPK-mTOR-mediated mitochondrial function to influence the oocyte-to-embryo transition of porcine

本研究探讨IP3R1在猪卵母细胞成熟及胚胎发育中的调控机制。通过2-APB抑制和siRNA干扰，结合Smart-seq分析发现IP3R1通过Ca2+/CAMKK2-AMPK/mTOR通路调节线粒体功能及能量代谢，促进胚胎发育关键阶段（卵母细胞MⅡ期、受精卵和2细胞期）的基因表达，包括eIF4E活性增强和SETD2、H3K36me3等表观遗传修饰。结果为优化体外胚胎生产系统提供理论依据。

　　

作者：滕然、徐宁、陈行福、邢云宁、孙晓晴、袁德鑫、黄克明、高乐鹏、李索

吉林农业大学，中国长春市新城区街道2888号，邮编130118

摘要

解码哺乳动物卵母细胞向胚胎转变（OET）所涉及的生物调控机制至关重要，这一过程由受精后的成熟卵母细胞激活引发。卵母细胞的成熟和激活同时受到肌醇1,4,5-三磷酸受体（IP3R1）/Ca²⁺信号通路的调控。本研究探讨了IP3R1在OET过程中的潜在作用机制。

本研究发现，使用特定IP3R1抑制剂2-氨基乙基二苯硼酸盐（2-APB）处理后，细胞内钙离子水平以及原核形成、胚胎裂变和囊胚形成的速率显著下降。为阐明IP3R1在OET中的作用机制，我们随后将靶向IP3R1的siRNA显微注射到MII期前的卵母细胞中以干扰其表达。通过Smart-seq分析，比较了对照组与使用非竞争性IP3R1抑制剂处理的卵母细胞之间的差异表达基因和潜在通路。在三个关键时间点（MII期、合子期和二细胞期）进行差异基因筛选，并结合GO和KEGG通路富集分析，我们发现IP3R1通过CAMKK2调控受精后的AMPK/mTOR平衡。这种调控作用调节线粒体功能和能量代谢，降低PGC1基因表达，上调TOMM40和Caspase3基因表达，促进ATP生成，上调ND1和ATP6基因表达，减少线粒体氧化应激，并降低活性氧（ROS）水平以及BAX、SOD2和CAT基因表达。总体而言，这些效应增强了真核生物翻译起始因子4E（eIF4E）的活性，并促进了组蛋白甲基化水平（表现为SETD2表达和H3K36me3水平的增加）。总之，本研究表明，IP3R1在体外成熟卵母细胞和体外激活卵母细胞中通过Ca²⁺/CAMKK2介导的AMPK–mTOR–eIF4E通路启动OET，从而促进OET和胚胎发育。本研究旨在为优化体外猪配子生产系统提供理论指导。

引言

哺乳动物生殖的启动依赖于两个基本生物学过程：卵母细胞成熟和卵母细胞激活。在这些过程中，母源mRNA的转录和翻译驱动卵母细胞向胚胎的转变（OET），标志着胚胎发育的开始[1]。了解OET的分子调控机制对于推进生殖生物学和解决辅助生殖中的挑战至关重要[2]。卵母细胞的成熟和激活都受到细胞内Ca²⁺信号的调控，这会触发一系列依赖Ca²⁺的时间依赖性事件，进而促进胚胎发育。尽管这两个过程中的Ca²⁺信号模式有所不同[3]，但Ca²⁺信号的时空动态与肌醇1,4,5-三磷酸受体1型（IP3R1）密切相关。

在猪卵母细胞的成熟过程中，GV期的Ca²⁺储备主要位于内质网（ER）中。2-氨基乙基二苯硼酸盐（2-APB）是一种特定的IP3R1抑制剂，它可以减少从ER到线粒体的Ca²⁺流动，从而减轻Ca²⁺过载引起的细胞损伤。Ca²⁺的动态平衡由线粒体相关内质网膜（MAM）上的钙通道蛋白IP3R调节[4]，同时激活钙调蛋白激酶（CaMK），直接或间接地触发成熟促进因子（MPF）活性的增加[5]。在卵母细胞激活过程中，关键的信号事件是肌醇1,4,5-三磷酸（IP3）与IP3R的结合，这一结合由精子来源的异源磷脂酶C-ξ（PLC-ξ）诱导。这种相互作用产生连续且有节奏的“Ca²⁺振荡[6,7]”，并启动一系列依赖Ca²⁺的事件，如皮质颗粒的释放、cyclin B及其依赖的细胞周期激酶（CDK1）活性的丧失、MAPK活性的恢复，从而降低MPF活性并促进减数分裂的重新开始。这导致细胞周期进入中期并释放第二极体[8]。随后形成的雄性和雌性原核细胞标志着减数分裂的完成[9]和OET的开始[10,11]。然而，在体外培养环境中，由于微环境的变化，内源性营养物质的供应不足，可能导致IP3R/Ca²⁺信号异常，从而导致卵母细胞体外成熟失败和胚胎发育受阻[12,13]。IP3R1调控OET以启动细胞命运转变的具体机制尚不清楚。

线粒体在卵母细胞成熟和早期胚胎发育中起着重要作用。作为钙离子受体，线粒体不仅参与调节钙稳态，还是卵母细胞中最重要的“能量中心”。IP3R1的缺乏显著影响IP3R1-GRP75-VDAC1蛋白相互作用，这是MAMs中钙信号通路的关键组成部分，导致Ca²⁺转运失衡。这种失衡会导致线粒体内Ca²⁺过度积累，最终损害线粒体功能[14,15]。线粒体功能直接影响精子诱导的卵母细胞激活和随后的胚胎发育[16]。研究表明，卵母细胞中的线粒体拷贝数和线粒体DNA（mtDNA）含量远高于其他细胞类型（每细胞约10⁵-10⁶拷贝）[17],[18],[19]。在卵母细胞晚期发育过程中，线粒体质量呈指数级增加，以满足减数分裂完成、受精和早期胚胎发生的能量需求。线粒体功能障碍表现为腺苷三磷酸（ATP）减少、mtDNA耗竭/突变、膜电位紊乱或活性氧（ROS）增加，这些都会影响染色体分离和纺锤体稳定性，加速端粒缩短，并降低卵母细胞质量，最终导致胚胎发育缺陷，凸显了线粒体完整性在生殖成功中的关键作用[20]。

在营养缺乏或线粒体功能障碍的情况下，ATP水平降低，导致AMP/ATP比率升高。作为进化上保守的腺苷一磷酸激活的蛋白激酶（AMPK）通路迅速被激活，其关键底物包括线粒体钙转运蛋白（MCU）[21]、脂肪酸生物合成中的关键酶乙酰辅酶A羧化酶（ACC）[22]以及哺乳动物雷帕霉素靶点（mTOR）[23]。AMPK磷酸化一组底物（如鸟苷三磷酸和磷酸果糖激酶），从而将代谢状态从合成状态转变为分解状态。这抑制了雷帕霉素复合体1（mTORC1）的合成，有助于恢复代谢平衡。AMPK的上游激酶（如CAMKK2）通过感知钙信号进一步调节AMPK活性，从而增强线粒体功能、分解代谢活动和ATP生成，以维持细胞过程[24]。大量证据表明，CaMKK2通路在激素或生长因子诱导的ER Ca²⁺释放（包括与Gq/G11偶联的G蛋白偶联受体相互作用产生的IP3R1）的作用下激活AMPK[25]。AMPK还通过转录调控促进长期代谢适应，下调合成基因，同时上调参与溶酶体和线粒体生物发生的基因。这有助于清除受损线粒体并支持细胞能量韧性[25]。AMPK激活增加线粒体生成，AMPKγ3的过表达在小鼠中增强线粒体生成[26]。AMPK对线粒体氧化代谢的调控需要过氧化物酶体增殖激活受体γ共激活因子1-α（PGC1α）的参与，AMPK通过p38 MAPK和HDAC5通路间接调节PGC1α的表达[27]。作为细胞能量代谢的关键调节因子和AMPK的主要下游靶点，mTOR与AMPK相互作用，维持“阴阳”平衡，这对于感知营养/能量水平和调节细胞生长至关重要[28]。AMPK和mTORC1之间的这种相互作用在哺乳动物发育的关键阶段（包括卵母细胞成熟、原始卵泡激活、早期卵泡生长和卵泡腔形成）中至关重要[29]。此外，Ca²⁺信号通过AMPK和mTORC1通路间接调节细胞能量平衡和功能[30]。

钙离子（Ca²⁺）作为重要的二级信使，直接影响组蛋白甲基化动态。最新研究表明，AMPK缺乏通过形成异常的R-loop结构影响基因组稳定性，进而引发异常的表观遗传修饰（如H3K4me3），损害生殖细胞的完整性和DNA损伤响应机制[31],[32],[33]。此外，mTOR在胚胎发育中起关键作用，通过调节真核生物翻译起始因子4F（eIF4E）发挥作用。在哺乳动物早期发育过程中，eIF4E的表达对于母源向胚胎的转变至关重要。受精后，eIF4E存在于卵母细胞和早期胚胎细胞的细胞质中，支持从母源遗传物质向胚胎蛋白质合成的转变。使用4EGI-1抑制eIF4E活性会导致细胞在二细胞阶段停止发育。此外，mTOR信号通路通过调节4E-BP1的磷酸化激活eIF4E翻译起始复合体，从而协调细胞质和线粒体中的蛋白质翻译，进而调节胚胎发育过程[34]。

为了阐明IP3R1的功能通路，本研究采用Smart-Seq技术探讨了IP3R1是否通过调节Ca²⁺来激活AMPK和mTOR通路，从而调节线粒体功能和表观遗传修饰，促进正常的OET启动。

试剂来源

所有与动物相关的实验程序均严格遵循《农业动物在研究和教学中的护理和使用指南》进行。除非另有说明，本研究中使用的化学物质和试剂均购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。

实验设计

在第一个实验中，我们旨在明确IP3R1在体外猪卵母细胞成熟（IVM）和早期胚胎发育中的作用。我们使用2-APB（一种特定的IP3R1抑制剂）处理卵母细胞

2-APB对猪卵母细胞成熟和早期胚胎发育的影响

作为IP3R/Ca²⁺信号通路拮抗剂，2-APB用于建立IVM和IVF过程中IP3R/Ca²⁺信号通路激活或抑制的细胞模型。通过检测卵母细胞成熟和早期胚胎发育情况，明确了IP3R/Ca²⁺信号通路在卵母细胞成熟和早期胚胎发育中的调控作用。为了评估IP3R1对猪卵母细胞的影响，首先比较了IP3R1抑制剂2-APB与对照组在IVM和早期胚胎发育中的效果

讨论

本研究表明，IP3R1在受精后OET过程中通过CAMKK2调节AMPK/mTOR信号通路。这种调控作用调节线粒体功能和能量代谢，促进ATP生成，减少氧化应激，并增强eIF4E活性，同时增加组蛋白甲基化。总之，IP3R1通过介导Ca²⁺/CAMKK2-AMPK–mTOR–eIF4E通路启动OET，支持胚胎发育，并为优化体外猪配子生产系统提供了见解。

结论

总之，本研究表明，IP3R1通过Ca²⁺/CAMKK2信号通路调节成熟卵母细胞和激活卵母细胞中的AMPK/mTOR平衡，从而调节线粒体功能和能量代谢，增强eIF4E活性并促进组蛋白甲基化（包括SETD2和H3K36me3），最终促进OET和胚胎发育（见图7）。

作者贡献声明

滕然：撰写初稿、方法学设计、数据分析。徐宁：方法学设计、数据分析。陈行福：方法学设计。邢云宁：方法学设计。孙晓晴：方法学设计、数据分析。袁德鑫：方法学设计。黄克明：方法学设计。高乐鹏：方法学设计、数据分析。李索：撰写、审稿与编辑、资源管理、项目协调、资金争取、数据分析、概念构思。

数据和材料的可用性

本研究生成或分析的所有数据均包含在本文中。

出版同意

不适用。

资助

本工作得到了吉林省科学技术厅（JJKH20261184KJ）的支持

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

我们感谢参与活动的中学对吉林大学的支持，感谢中学生孙玉彤进入实验室并参与实验。