《Theriogenology Wild》：A first report of organoids derived from rhinoceros endometrium
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为应对濒危野生动物难以开展活体生殖研究、样本稀缺的难题，本研究首次尝试将马和牛的子宫内膜类器官培养方法应用于两种犀牛（南黑犀和印度犀）的死后子宫内膜组织。结果显示，南黑犀类器官成功构建但增殖缓慢，而印度犀组织未能建立类器官，凸显了物种特异性差异及优化培养体系的必要性。该研究证明了利用生物样本库资源建立濒危物种生殖模型的可能性，为辅助生殖技术优化和物种保护策略提供了关键工具。
在全球生物多样性持续衰退的背景下，拯救濒危物种已成为刻不容缓的任务。辅助生殖技术（Assisted Reproductive Technologies, ART）如体外受精和胚胎培养，是保护珍稀动物、维系种群基因多样性的有力武器。然而，这些技术的成功应用建立在对物种特定生殖生理的深刻理解之上，而这恰恰是许多野生动物研究的盲区。与人类或常见家畜不同，对濒危物种进行直接的生殖实验往往面临巨大的伦理、实践和技术挑战。一方面，活体采样困难重重；另一方面，获取的样本（尤其是生殖组织）极为有限，大多只能来自动物死亡之后。如何在不伤害动物的前提下，深入研究其生殖机理并优化辅助生殖方案？科学家们将目光投向了方兴未艾的类器官技术。
类器官是一种三维（3D）细胞培养物，它由多种细胞类型自我组织形成，能够长期保持来源器官的特性，被誉为“培养皿中的迷你器官”。当它来源于生殖组织时，便为研究配子发生、胚胎发育和生殖障碍提供了宝贵的体外模型。此前，子宫内膜类器官已在人类、小鼠以及马、猪、牛、猫、狗等多种家养动物中成功建立，甚至包括濒危的普氏野马。那么，对于更为珍稀、研究基础更薄弱的犀牛，是否也能建立类似的模型呢？发表于《Theriogenology Wild》的一项研究对此进行了首次探索。
为了回答这个问题，研究团队运用了基于马和牛子宫内膜类器官培养的成熟方法。他们利用死后机会性采集的组织样本，包括一例南黑犀（Diceros bicornis minor）和一例印度犀（Rhinoceros unicornis）的子宫，以及作为对照的马和牛组织。关键的技术流程包括：组织采集与冷冻保存、子宫内膜腺体碎片的酶解消化与分离、细胞在基底膜提取物（ECM）中的三维培养与维持，以及通过定期传代、显微镜观察和病理学染色（如H&E和PAS染色）来评估类器官的生长与功能。
研究结果：犀牛类器官的初步建立与形态特征
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样本来源与动物健康状况：研究所用的南黑犀因慢性跛行和蹄脓肿被安乐死，年龄34.55岁，经产，总体健康状况尚可。印度犀则因健康状况恶化被安乐死，年龄18.7岁，经产。两者组织均在死后获取，其中印度犀组织在采集前经历了约18小时的冷藏。
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类器官的建立与形态特征：研究得出了两个主要结论。首先，南黑犀子宫内膜成功建立了类器官，其在35天的培养期内表现出生长和增殖。然而，其形态更为致密，增殖速率远慢于在相同条件下培养的马和牛类器官。例如，培养第10天时，一个培养孔中仅有7个南黑犀类器官直径大于250微米，而马和牛类器官中分别有至少45个和28个大于此尺寸。组织学显示，南黑犀类器官结构不规则，有的具有中央腔隙，周围细胞层紊乱，内含囊性结构；有的则为致密的多细胞息肉样结构，无中央腔，但有不规则大小的细胞质空泡和细胞间囊性结构。PAS（过碘酸雪夫）染色阳性表明细胞具有向腔面分泌黏蛋白的功能。
其次，来自印度犀子宫内膜的细胞在培养10天后未显示任何增殖迹象，因此培养被终止。相比之下，马和牛子宫内膜类器官在明场显微镜下呈圆形囊状结构，组织学显示具有清晰的中央腔和单层细胞环绕，PAS染色显示黏蛋白分泌阳性，且染色在近腔面增强。
结论与讨论：机遇、挑战与未来方向
本研究首次报告了从犀牛子宫内膜成功建立类器官（尽管仅限于南黑犀），这为濒危物种生殖研究开辟了新路径。类器官模型能从微小组织样本产生可持续的细胞系，保留物种和个体的生物学特性，是研究子宫内膜容受性、病理状态和激素反应的强大工具。对于濒危物种，源自高遗传价值个体的类器官可作为“活体生物样本库”，用于未来生殖组织建模、药物筛选等，即使在动物死亡后仍能发挥作用，有助于圈养辅助繁殖项目中的遗传多样性长期管理。
然而，研究也清晰揭示了将家畜方法直接应用于野生动物的挑战。南黑犀类器官生长缓慢、形态特异，而印度犀组织则完全未能建立类器官。这可能是多种因素共同作用的结果：1）物种特异性生物学差异：尽管马（奇蹄目）与犀牛（也属于奇蹄目）在分类学上比牛（偶蹄目）更接近，但犀牛子宫内膜细胞可能仍需要不同的培养基成分。2）样本获取的固有局限：犀牛子宫颈长而曲折，无法像家畜那样进行活体子宫内膜活检，组织只能来自死亡个体。这些个体往往年老或患有严重疾病，其组织健康状态可能不理想。3）死后处理延时：对大型动物进行尸检并采集组织耗时较长（本研究中最长达24小时），这可能影响细胞活性和类器官生长潜力。
这些发现突显了优化培养条件的必要性。未来研究需要更多来自不同健康状况犀牛的样本重复，以区分疾病状态、采样延时和培养基成分对类器官生长的影响。优化方向可能包括调整培养基添加剂，例如参考其他物种经验尝试移除胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS）和SB202190，或添加R-Spondin-1和肝细胞生长因子（HGF）。最终目标是建立稳定、可复制的犀牛生殖类器官培养体系。
总之，这项初步研究验证了利用生物样本库中的犀牛生殖组织建立类器官模型的可行性，同时揭示了显著的物种特异性障碍。它强调了在“同一个健康”框架下，开发和应用适用于野生动物的人工生殖技术模型所面临的复杂性和必要性。通过持续优化，类器官技术有望成为理解和保护犀牛等珍稀物种生殖健康、进而推动生物多样性保护的关键创新工具。
