盲肠结扎和穿刺诱导的脓毒症小鼠空肠5-羟色胺合成与代谢的变化

《Toxicology and Applied Pharmacology》：Alterations in the jejunal 5-hydroxytryptamine synthesis and turnover in septic mice induced by cecal ligation and puncture

败血症小鼠模型显示肠道5-羟色胺（5-HT）代谢动态变化：早期（3-6h）5-HIAA升高提示5-HT降解加速，24h后5-HT水平回升，伴随色氨酸羟化酶-1（TPH1）和血清素转运体（SERT）表达时序性变化，单胺氧化酶-A（MAO-A）活性在12h上升后抑制。研究揭示了5-HT合成-降解平衡与肠道损伤、炎症反应的关联，为靶向5-HT代谢治疗败血症提供依据。

　　

黑田绫人（Ayata Kuroda）|町田卓二（Takuji Machida）|平出幸子（Sachiko Hiraide）|山本隆宏（Takahiro Yamamoto）|阿部由希子（Yukiko Abe）|熊谷隼人（Hayato Kumagai）|津田圭人（Sayato Tsuda）|波末直也（Naoya Hamaue）|飯塚健二（Kenji Iizuka）|服部裕一（Yuichi Hattori）|松田直之（Naoyuki Matsuda）

北海道健康科学大学药学部药理学科学系，日本北海道石狩郡苫别町 061-0293

摘要

近期研究表明，内源性5-羟色胺（5-HT）会促进败血症病理的发展。本研究旨在探讨通过盲肠结扎和穿刺（CLP）手术诱导的败血症对小鼠空肠中5-HT合成及代谢系统的影响，观察不同病理阶段的变化。我们在CLP手术后的3小时、6小时、12小时、24小时和48小时分别采集空肠组织样本。研究发现，CLP手术导致的败血症会引起显著的体重下降和肠道损伤，包括绒毛萎缩，并伴有促炎细胞因子的表达。我们还发现，败血症在不同的病理阶段会改变5-HT的合成和降解过程：在3–6小时时5-羟基吲哚乙酸（5-HT的最终代谢物）的水平升高，而在24小时时5-HT的水平上升。CLP手术后，色氨酸羟化酶1（TPH1）和血清素转运蛋白的表达在特定时间点增加；同时，单胺氧化酶A（MAO-A）蛋白的表达在12小时时上升，而在12至48小时期间其活性显著下降。这些发现为了解败血症不同阶段5-HT的合成与降解机制提供了重要线索，可能有助于制定调节5-HT代谢的治疗策略。

引言

败血症被定义为由于机体对感染的异常反应而引发的危及生命的器官功能障碍（Srzi?等人，2022年）。严重感染可导致败血症，进而引发败血性休克、多器官功能障碍综合征和多器官衰竭（Rossaint和Zarbock，2015年；Sganga，2015年）。在败血症的发展过程中，细胞内会激活多种受体，从而激活核因子-kB、激活蛋白-1（AP-1）和信号转导因子-3（STAT3）等转录因子（Hattori等人，2017年；Hattori等人，2018年）。这种激活促进了炎症分子的转录，包括诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和通过环氧化酶-2（COX-2）产生的前列腺素、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）和IL-6等炎症细胞因子、黏附分子以及C反应蛋白的生成。

最新研究表明，5-羟色胺（5-HT）在败血症的发展中起着重要作用（Zhang等人，2017年；Huang等人，2022年；Cao等人，2023年）。超过90%的5-HT由胃肠道黏膜中的肠嗜铬细胞产生。5-HT由色氨酸羟化酶1（TPH1）合成，该酶是限速步骤，主要通过单胺氧化酶A（MAO-A）降解。此外，血清素转运蛋白（SERT）通过调节5-HT进入细胞来调节其可用性。组织中的5-HT浓度取决于这些酶的合成和代谢速率（Mohammad-Zadeh等人，2008年）。与5-HT合成和代谢相关的酶以及SERT表达的异常与多种疾病有关。例如，SERT下调导致的5-HT浓度升高已被证实与肠易激综合症（IBS-D）有关，目前已有5-HT?受体拮抗剂作为治疗方法（Moore等人，2013年；Gao等人，2022年）。此外，我们的实验室还发现，抗癌药物顺铂可增强TPH的活性和表达，同时降低MAO的活性，从而增加小鼠小肠中的5-HT含量（Ju等人，2008年）。这一发现提示这些变化可能与顺铂引起的呕吐和胃肠道紊乱有关（Ju等人，2008年）。

与野生型小鼠相比，TPH1基因敲除（TPH1?/?）小鼠在经历盲肠结扎和穿刺（CLP）诱导的败血症后生存率有所提高（Zhang等人，2017年）。然而，给予5-羟色氨酸（5-HT的前体）会降低TPH1?/?小鼠的生存率（Zhang等人，2017年）。另外，在暴露于脂多糖（LPS）的情况下，TPH1?/?小鼠的生存率优于野生型小鼠（Huang等人，2022年）。还有研究表明，在CLP后24小时，TPH1、SERT和MAO-A在结肠中的mRNA表达水平上升（Cao等人，2023年）。这些结果表明5-HT可能在败血症病理发展中起促进作用。然而，败血症过程中肠道5-HT代谢的具体变化仍不完全清楚。研究表明，5-HT的主要来源——肠嗜铬细胞在大肠中的密度高于小肠（Wheatcroft等人，2005年）。相比之下，小肠的黏膜层较薄，更容易受到炎症和环境因素的影响（Bowcutt等人，2014年）。特别是空肠对炎症、缺血和细胞因子的反应强烈，使其成为检测疾病初期病理变化的高度敏感部位（Bowcutt等人，2014年）。

在本研究中，我们利用与人类临床败血症高度相关的CLP小鼠模型，探讨了不同病理阶段空肠中5-HT合成和代谢的变化。我们重点研究了TPH1、SERT和MAO-A的表达和/或活性，并分析了5-羟基吲哚乙酸（5-HIAA）与5-HT的比值，作为5-HT代谢的生理指标。此外，我们还分析了5-HT稳态的破坏如何与空肠黏膜损伤和炎症细胞因子的诱导相关。

动物模型与败血症研究

实验所用雄性BALB/c小鼠购自日本SLC公司（静冈）。所有动物均置于室温22±2°C、湿度50±10%的恒定环境中，光照时间为每天12小时（8:00–20:00），黑暗时间为12小时（20:00–8:00），并可自由摄取水和食物。实验操作符合北海道健康科学大学动物研究委员会制定的《实验动物护理和使用指南》（批准编号：23–013）。

一般观察与体重变化

在本研究中，我们观察了CLP手术后小鼠的败血症临床表现。与先前的研究结果一致（Yamashita等人，2018年；Imbaby等人，2020年），CLP手术后的小鼠对周围环境缺乏兴趣，出现毛发竖立现象，眼睛周围有结痂性渗出物。而假手术组小鼠在整个实验期间保持健康并自由活动。

讨论

研究表明，CLP手术诱导的败血症会导致显著的体重下降和肠道损伤，包括绒毛萎缩，并伴有促炎细胞因子的表达。我们还发现，败血症在不同病理阶段会改变5-HT的合成和降解过程。值得注意的是，这些变化表现为早期5-HIAA水平升高（3–6小时），随后在24小时时5-HT水平发生变化。

作者贡献声明

黑田绫人（Ayata Kuroda）：撰写初稿、数据可视化、实验设计、数据分析。 町田卓二（Takuji Machida）：撰写初稿、数据可视化、实验监督、资源协调、项目管理、数据分析、概念构思。 平出幸子（Sachiko Hiraide）：实验设计、数据分析。 山本隆宏（Takahiro Yamamoto）：实验设计。 阿部由希子（Yukiko Abe）：实验设计。 熊谷隼人（Hayato Kumagai）：实验设计。 津田圭人（Sayato Tsuda）：实验设计。 波末直也（Naoya Hamaue）：撰写、审稿与编辑、方法学设计。 饭塚健二（Kenji Iizuka）：撰写、审稿。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。

致谢

JSPS KAKENHI（项目编号：22H03173，资助人：N.M.、Y.H.、T.M.）部分支持了本研究的开展。