《Toxicology in Vitro》：Epigenetic regulation of intestinal innate immunity during differentiation of Caco-2 cells under inflammatory stress
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肠道上皮细胞分化阶段依赖的表观遗传调控机制研究。通过建立Caco-2细胞分化模型，发现未分化阶段DSS刺激可导致DEF5A和SOX9基因持续表达抑制及启动子区DNA甲基化增加，伴随DNMT1/3B表达上调。实验证实早期DNMT1抑制可通过GSK-3484862部分逆转DSS对DEF5A/SOX9的抑制作用。
上村一平|高桥铃子-铃木|佐藤隆
北海道大学理学部药学部药学系，日本札幌市手稲区前田7-15-4-1，邮编006-8585
摘要
肠道上皮支持抗菌程序和上皮屏障功能；尽管表观遗传机制在这些过程中越来越受到关注，但在炎症应激下，分化阶段如何影响关键先天免疫基因的表观遗传调控仍不清楚。我们在一个受控的Caco-2分化框架中，研究了与肠道先天免疫相关的基因在分化阶段的表观遗传调控，重点关注α-防御素5（DEFA5）和SRY-box转录因子9（SOX9）。将人结肠来源的Caco-2细胞培养2-14天，并短暂暴露于硫酸葡聚糖钠（DSS）作为体外上皮炎症刺激物。评估了DEFA5、SOX9、奇数跳跃相关转录因子1（OSR1）和受体相互作用蛋白140（RIP140）的启动子DNA甲基化和基因表达。在未分化阶段暴露于DSS会导致DEFA5和SOX9的持续抑制，同时伴有DNMT1/3B表达的增加，以及SOX9相关转录因子（OSR1和RIP140）表达的改变。在早期分化过程中使用GSK-3484862暂时抑制DNMT1可部分恢复DSS引起的DEFA5和SOX9的抑制，并使启动子甲基化读数向对照组方向转变。总体而言，早期炎症暴露在这个体外模型中对Paneth细胞相关的先天免疫基因程序施加了持久的表观遗传限制，为了解上皮分化阶段如何影响持续的先天免疫失调提供了见解。
引言
炎症性肠病（IBD），包括克罗恩病和溃疡性结肠炎，是一种慢性胃肠道炎症性疾病，会显著影响生活质量（Knowles等人，2018年）。其发病机制反映了遗传易感性、环境暴露和免疫失调之间的多因素相互作用，其中上皮屏障的破坏不仅是炎症的结果，还是放大微生物移位和黏膜免疫激活的驱动因素（Atuma等人，2001年；Keita和S?derholm，2010年）。尽管当前的治疗方法可以抑制炎症并维持缓解，但尚无根治方案，因此对早期上皮事件的机制理解在临床上仍然具有重要意义（Cai等人，2021年）。自噬和上皮应激反应等途径中的遗传风险变异进一步支持了上皮内在脆弱性导致IBD发生和持续存在的观点（Adolph等人，2013年；Larabi等人，2020年）。
肠道上皮由专门的细胞谱系组成，这些细胞谱系共同维持屏障完整性和先天防御。其中，Paneth细胞位于隐窝基底，分泌抗菌肽，包括α-防御素5（DEFA5），这些抗菌肽可以塑造微生物群并有助于黏膜稳态（Bevins和Salzman，2011年；Wehkamp和Stange，2020年）。Paneth细胞功能障碍和DEFA5水平的变化与克罗恩病有关，而且这种损伤与持久的表观遗传改变有关（Perminow等人，2010年；Cerrillo等人，2018年）。在克罗恩病患者的回肠黏膜中，报道了DEFA5位点的持续高甲基化以及DEFA5表达的降低，这表明抗菌缺陷可能根植于调控层，而不仅仅是短暂的细胞因子暴露的结果（Cerrillo等人，2018年）。
与Paneth细胞相关的转录程序对于抗菌作用至关重要。SRY-box转录因子9（SOX9）对于Paneth细胞的分化是必需的，并参与肠道上皮中的Paneth细胞相关基因程序（Mori-Akiyama等人，2007年；Wehkamp和Stange，2020年）。SOX9相关的上皮改变也与克罗恩病相关的上皮表型有关（Roda等人，2009年；Hamadou等人，2020年）。尽管越来越多的证据表明表观遗传调控参与了IBD的发病机制（Low等人，2013年），但一个关键未解决的问题是，在上皮分化的特定阶段施加的炎症应激是否能够建立持久的表观遗传改变，从而限制随后的先天免疫基因表达，包括SOX9/DEFA5相关程序（Agliata等人，2020年）。这个时间点问题很重要，因为上皮分化是逐步进行的；因此，相同的炎症刺激根据暴露时的分化状态可能会产生不同的长期后果。
在体内直接分离依赖于分化的早期表观遗传事件具有挑战性。基于DSS的结肠炎模型能够有效诱导上皮损伤和炎症，但炎症级联反应是动态发展的，而且肠道组织由异质的上皮和免疫细胞群体组成，这使得细胞状态分辨的调控分析和将持久变化归因于早期上皮损伤变得复杂（Okayasu等人，1990年；Chassaing等人，2014年）。因此，我们利用了一个基于人类来源的、具有明确分化阶段的体外框架，在该框架中可以精确控制炎症暴露和随后的成熟时间，从而量化短暂上皮损伤的持续分子后果（Uemura等人，2024a）。
Caco-2细胞来源于结肠腺癌细胞，不能完全模拟真正的Paneth细胞；然而，在明确的培养条件下，它们可以表达与Paneth细胞相关的标志物，包括DEFA5和溶菌酶（LYZ），并提供了一个可行的框架来研究人类上皮背景下的分化阶段依赖性调控（Brodrick等人，2011年；Yasuda等人，2021年）。先前的研究已经表明，Caco-2细胞在特定条件下可以表达与Paneth细胞相关的基因，并且在培养过程中会逐渐分化（Jochems等人，2019年；Yasuda等人，2021年；Uemura等人，2024a）。然而，尚不清楚在上皮成熟的早期阶段或后期施加的炎症刺激是否会导致持久的表观遗传改变，从而限制随后的Paneth细胞相关基因程序。
因此，利用我们定义的分化阶段Caco-2框架（Uemura等人，2024a），我们研究了在不同成熟阶段短暂暴露于DSS是否会导致DEFA5和SOX9的表达和启动子甲基化的持续变化。我们进一步评估了DNA甲基转移酶异构体（DNMT1、DNMT3A和DNMT3B）的表达，并评估了与分化相关的转录调控有关的SOX9相关调节因子（OSR1和RIP140）（Wang等人，2018年；Gleizes等人，2021年）。通过关注阶段定义的炎症暴露，这项研究提供了关于早期上皮应激如何与体外Paneth细胞相关先天免疫程序的持续表观遗传抑制相关的机制见解。
化学物质
DSS（36–50 kDa）购自MP Biomedicals（日本东京）。GSK-3484862购自TargetMol（美国马萨诸塞州波士顿）。GSK-3484862是一种非共价且选择性地抑制DNMT1的抑制剂，与5-氮杂核苷相比，它作为一种工具化合物可以诱导DNA低甲基化，且具有较低的非特异性细胞毒性（Azevedo Portilho等人，2021年）。Lipofectamine? RNAiMAX转染试剂购自Thermo Fisher Scientific（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）。所有其他试剂均为最高质量。
根据分化阶段，DEFA5对DSS暴露的差异反应
根据实验1和2收集细胞裂解物和培养上清液，并评估了DEFA5蛋白的丰度和分泌情况（图1）。实验1中，细胞内DEFA5蛋白水平和分泌的DEFA5水平显著降低（图2A和B）。与分泌谱系程序（包括Paneth细胞相关基因表达）相关的转录因子SOX9蛋白表达也在实验1中显著降低（图2C）。
为了进一步评估Paneth细胞相关...
讨论
最近的研究强调了转录因子SOX9在IBD发病机制中的作用，特别是通过调节Paneth细胞分化和肠道上皮稳态（Roda等人，2009年；Hamadou等人，2020年）。在我们之前的工作中，我们开发了一个具有明确分化阶段的Caco-2分化框架，以便在未分化阶段进行短暂的DSS暴露——这一暴露窗口在体内难以分离——并表明DEFA5对DSS的反应因...
结论
本研究表明，在Caco-2培养物的未分化阶段短暂暴露于DSS会导致成熟后Paneth细胞相关抗菌标志物的持续抑制，同时伴随着检测到的DEFA5和SOX9区域的启动子甲基化增加以及DNMT1和DNMT3B的上调。DEFA5的敲低进一步增加了DNMT1和DNMT3B的表达，支持了DEFA5状态与这种上皮框架中甲基化“写入”调控之间的耦合。
CRediT作者贡献声明
上村一平：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，可视化，验证，项目管理，方法学，研究，正式分析，数据管理。高桥铃子-铃木：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，监督，项目管理，研究，资金获取。佐藤隆：撰写 – 审稿与编辑，监督。
资助
本工作得到了日本学术振兴会（KAKENHI）[资助编号JP 24K14795]的支持，提供给NS。
未引用的参考文献
Bastide等人，2007
Hung等人，2021
Kubota等人，2018a
Schmitt等人，2018
Tolle等人，2024
van Es等人，2019
Xu等人，2020
利益冲突声明
作者声明没有利益冲突。
致谢
