基于组学技术的发现与功能分析：Da-29——一种来自Deinagkistrodon acutus毒液中的生物活性丝氨酸蛋白酶，具有抗血栓活性

《Toxicon》：Omics-guided discovery and functional profiling of Da-29, a bioactive serine protease from Deinagkistrodon acutus venom, with antithrombotic activity

本研究利用PacBio全长转录组测序和标签自由定量蛋白质组学技术，从五步蛇（D. acutus）毒腺中筛选并鉴定出一种具有抗凝血活性的SVSP成员Da-29。通过纯化、结构解析及体外凝血酶样活性检测，证实Da-29通过选择性水解纤维蛋白原Aα/Bβ链发挥抗血栓作用，且在动物模型中显示剂量依赖性抗凝血效果，同时出血风险可控。该研究验证了多组学策略在高效识别低丰度功能性蛋白中的核心价值。

　　

陈超娟|丁鹏|陶新如|李静溪|刘平安|蔡源|彭艳梅

湖南中医药大学，中国湖南长沙

摘要

背景

蛇毒丝氨酸蛋白酶（SVSPs）是重要的毒性成分，它们会干扰血液凝固平衡，并成为抗凝药物开发的关键候选库。尽管Deinagkistrodon acutus的蛇毒中含有多种SVSPs，但对于具有凝血酶样活性的低丰度SVSPs的系统研究仍然有限。因此，本研究旨在利用综合多组学方法从D. acutus的蛇毒中分离并鉴定一种具有生物活性的SVSP候选物，并评估其抗血栓作用和出血风险。

方法

本研究结合PacBio全长转录组测序和无标记定量蛋白质组学技术，筛选具有匹配转录-翻译关联的SVSP候选物。目标蛋白Da-29通过凝胶过滤和反相色谱法进行纯化，其一级结构通过转录组测序和液相色谱-串联质谱法得到确认。体外实验评估了其酶活性和纤维蛋白原水解特异性，体内实验则通过啮齿动物血栓形成和出血模型评估了其抗血栓效果和出血风险。

结果

Da-29是一种含有260个氨基酸的SVSP，具有保守的催化三联体和S1底物结合口袋。它表现出显著的酰胺酶活性和纤维蛋白原凝固活性，并能选择性水解纤维蛋白原的Aα和Bβ链。此外，在有效剂量下，Da-29在体内表现出剂量依赖性的抗血栓作用，延长凝血时间，降低纤维蛋白原/TXB2水平，并上调6-酮-PGF1α的表达，且不会引起显著的出血风险。

结论

Da-29具有与纤维蛋白原降解相关的抗血栓活性，并伴随TXB₂和6-酮-PGF1α水平的变化，这表明它具有作为抗血栓实验候选物的潜力。这种综合组学策略能够有效识别蛇毒中的低丰度生物活性分子，为天然产物中功能性蛋白质的发现提供了可重复的研究范例。

引言

蛇毒是一种复杂的生物分泌物，包含蛋白质、肽和其他生物活性分子（Tasoulis和Isbister，2017）。根据蛇的种类、栖息地和捕食策略，蛇毒具有多种生物活性，如细胞毒性、神经毒性、血液毒性和肌肉毒性（Pla等人，2019；Casewell等人，2020；Tasoulis等人，2021）。这种组成和功能的多样性使得蛇毒成为天然活性物质的重要宝库。然而，对其进行系统分析和功能探索仍面临重大挑战（Mohamed等人，2019）。

近年来，组学技术的快速发展为蛇毒研究带来了革命性的突破。通过应用基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学分析，研究人员可以全面研究蛇毒的组成、进化机制和病理效应（Sunagar等人，2016；Modahl等人，2021；Hussain和Kingsley，2025）。这种全面分析克服了传统技术对高丰度蛋白质的依赖性，同时也为低丰度活性分子提供了有针对性的信息。

在蛇毒的各种成分中，蛇毒丝氨酸蛋白酶（SVSP）成员数量较多，功能复杂，由于它们能够干扰凝血系统而受到广泛关注（Thakur等人，2024）。这些酶可以通过多种机制干扰正常的凝血过程，包括降解纤维蛋白原、激活特定的凝血因子或影响血小板功能，从而在体内同时发挥促凝和抗凝作用（Serrano和Maroun，2005；Serrano，2013）。凝血酶样酶（TLEs）具有高度特化的功能，因为它们可以通过特异性水解纤维蛋白原的Aα和/或Bβ链来模拟凝血酶的某些功能。TLEs与凝血酶的不同之处在于它们不会激活凝血因子XIII或诱导血小板聚集（Ullah等人，2018；Lotto等人，2021）。这种作用机制导致TLEs形成的纤维蛋白凝块不稳定。人体的纤溶系统会迅速清除这些血凝块，最终消耗纤维蛋白本身，产生纤溶效应（Ullah等人，2018；Pradniwat和Rojnuckarin，2014）。此外，活性位点周围环状结构的氨基酸组成和长度影响蛇毒凝血酶样酶（SVTLEs）的底物特异性，使它们能够逃避生理凝血级联反应的负反馈调节。这一现象可以用于抗凝药物的设计（Ullah等人，2018）。例如，从Gloydius halys Pallas中分离出的agkihpin可以增强ADP诱导的血小板聚集，并显著减少血栓素诱导的血栓形成。这种效应是通过水解纤维蛋白原的Aα/Bβ链实现的，且似乎不会增加出血风险（Xie等人，2016）。这一发现表明，通过调整凝血系统和纤溶系统之间的平衡，SVTLEs可以作为抗凝治疗的候选物。

Deinagkistrodon acutus是一种原产于中国南部和越南北部的毒蛇（Chan等人，2023）。D. acutus在传统中医中已被用于治疗中风和类风湿性关节炎。研究表明，D. acutus的蛇毒含有多种活性成分，如金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶和C型凝集素，这些成分具有多种药理活性，如抗血栓、抗肿瘤、抗菌和抗炎作用（Chen等人，2019；Mohamed等人，2019）。虽然已经成功鉴定出某些活性蛋白，如acutin和defibrase，但蛇毒中仍需进一步探索具有新颖结构和独特功能的蛋白质成分。因此，本研究利用PacBio全长转录组测序和无标记蛋白质组学技术全面分析了D. acutus的蛇毒，确定了其毒素组成和表达特征。通过整合转录组和蛋白质组学分析，筛选出了具有完整功能域和TLE分支归属的SVSP家族成员作为候选分子。随后，成功筛选并纯化了一种具有凝血酶样活性的丝氨酸蛋白酶Da-29，并对其凝血酶样活性、体内抗血栓潜力及出血安全性进行了功能研究。这些发现不仅为抗凝药物开发提供了潜在的先导化合物，也验证了组学引导筛选在复杂天然产物系统中高效识别功能性活性分子的核心价值。

章节片段

蛇毒和蛇毒腺

D. acutus的粗蛇毒和蛇毒腺购自湖南永州医世生物制药有限公司。蛇毒腺采集于2022年10月12日，立即在液氮中快速冷冻，然后储存以备RNA提取。蛇毒采集于2022年10月9日。部分粗蛇毒直接用于蛋白质组学分析，其余部分则冻干后储存在-20°C以备后续纯化。为确保样本一致性，使用了10克的粗蛇毒。

转录组特征和功能注释

使用PacBio Sequel平台对D. acutus的蛇毒腺组织进行了全长转录组测序，获得了42.72 Gb的原始数据。经过组装和CD-HIT聚类去除冗余后，得到了8471个非冗余转录本，N50值为3.002 kb。这一结果表明了良好的长读长覆盖率和高质量的组装效果。编码序列（CDS）预测显示，8414个（99.33%）转录本具有蛋白质编码潜力，其中2809个（33.38%）

讨论

D. acutus的蛇毒主要由蛇毒金属蛋白酶（SVMPs）、C型凝集素样蛋白（CTLs）和SVSPs组成，这些毒素家族是导致中毒后出血和止血障碍的主要因素，包括血管损伤和血小板功能紊乱。尽管这些成分含量丰富，但将其转化为有用的生物技术产品仍然具有挑战性。

结论

本研究通过结合转录组学和无标记4D蛋白质组学的综合策略，从D. acutus的蛇毒腺中筛选并纯化了SVSP家族成员Da-29。Da-29属于TLE分支，含有260个氨基酸，具有保守的催化三联体（His57、Asp102和Ser195）以及S1底物结合口袋。体外实验确认了其浓度依赖性的酰胺酶活性和纤维蛋白原凝固活性。

CRediT作者贡献声明

陈超娟：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿撰写，可视化，验证，方法学，研究，正式分析，数据管理。丁鹏：撰写 – 审稿与编辑，验证，方法学，研究，正式分析。陶新如：撰写 – 原稿撰写，验证，方法学，研究，正式分析。李静溪：验证，方法学，研究，正式分析。刘平安：验证，资源获取，方法学，资金申请。蔡源：撰写

伦理声明

动物实验方案已获得湖南中医药大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准（编号HNUCM21-202401-10，2024年10月1日）。

资助

本研究得到了中国湖南省自然科学基金的资助（资助编号：2023JJ60460）。

利益冲突声明

作者声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

我们感谢所有参与这项合作研究的成员。在准备本工作时，作者使用了DeepSeek工具来改进论文的语言。使用该工具后，作者对内容进行了必要的审阅和编辑，并对出版物的内容负全责。