《The Veterinary Journal》：Identification of conserved vaccine targets in
Mycoplasma bovis through integrated pan-genome and reverse vaccinology approaches with
in vivo immunogenicity and safety evaluation
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牛支原体（Mycoplasma bovis）是导致牛呼吸道疾病的主要病原体，本研究通过分析80株全球分离株的泛基因组，鉴定出1058个核心基因，并利用反向疫苗学和免疫信息学筛选出LplA、LepA、GAPDH三个候选疫苗蛋白。重组蛋白经大肠杆菌表达纯化后，对30只小鼠进行免疫实验，结果显示LplA和GAPDH诱导的抗体滴度显著高于LepA，且均激活Th2型免疫应答，产生高效IgG2a抗体，同时未观察到不良反应。这些成果为开发广谱且安全的牛支原体亚单位疫苗提供了理论依据和候选靶点。
Jiaming Mu|Zhongmei Ma|Jie Li|Xuepeng Cai|Qingling Meng|Jun Qiao
新疆石河子大学动物科学与技术学院，新疆石河子832003
摘要
Mycoplasma bovis是导致牛呼吸道疾病的主要病原体，给养牛业带来了巨大的经济损失。为应对这一挑战，我们对来自全球的80个M. bovis基因组进行了全基因组分析，鉴定出了1058个核心基因。随后，我们结合反向疫苗学和免疫信息学方法，筛选出了三种潜在的疫苗候选蛋白：脂酸蛋白连接酶2（LplA）、延长因子4（LepA）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）。经过密码子优化后的基因序列被克隆到pET-28a载体中，并利用E. coli表达系统成功表达和纯化。30只BALB/c雌性小鼠被随机分为五组（每组6只）。初次免疫时，每只小鼠通过皮下注射接受100 μg的重组蛋白（含有Fr Freund完全佐剂），并在第2周和第4周接受含有Fr Freund不完全佐剂的50 μg重组蛋白加强免疫。初次免疫14天后，所有接种组均表现出显著升高的抗原特异性抗体水平，这种高水平一直持续到第6周。值得注意的是，rLplA和rGAPDH诱导的抗体滴度高于rLepA。IgG2a/IgG1亚型比例的分析表明，rLplA、rGAPDH和rLepA主要引发了Th2型免疫反应。此外，这三种重组蛋白均显著增加了细胞因子的产生。在整个免疫期间，未观察到任何不良生理反应或组织病理学异常，证实了这些候选蛋白的安全性。总体而言，这些发现为开发针对M. bovis的亚单位疫苗提供了有希望的目标，以应对病原体的变异性、抗生素耐药性以及现有疫苗的有限疗效。
引言
Mycoplasma bovis是一种重要的病原体，影响着全球的牛肉和乳制品产业，可引发多种疾病，包括传染性牛胸膜肺炎、乳腺炎、关节炎和生殖障碍（V?h?nikkil?等人，2019年）。这些感染导致犊牛死亡率增加，成年牛的生产力下降，并给全球畜牧业带来了巨大的年度经济损失（Zhang等人，2022年）。近几十年来，集约化养殖系统的扩张以及牛只的频繁跨区域流动促进了该病原体在亚洲、欧洲和美洲主要养牛区的广泛传播（Lysnyansky和Ayling，2016年）。此外，某些菌株的遗传变异与毒力的增强和抗菌素耐药性的上升有关，进一步增加了疾病控制的难度（Khalil等人，2015年；Gautier-Bouchardon等人，2014年）。最近的一项全球荟萃分析估计，2000年至2024年间，全球牛群中M. bovis的感染率为32%，其中包含的流行病学数据涵盖了奶牛场和单个牛群。东地中海地区的感染率为43.2%，明显高于东南亚（2.1%）。水牛的携带率（63.8%）远高于牛（35.3%）。值得注意的是，自2020年以来，感染率急剧上升，到2023年达到了53.8%。这一上升趋势可能与国际畜牧业贸易的加剧以及诊断方法的改进有关（Su等人，2025年）。
目前，抗菌治疗仍然是控制M. bovis感染的核心手段，氟喹诺酮类药物因其强大的杀菌活性而被广泛使用。然而，其临床疗效逐渐下降。通过对2008年至2023年间收集的中国分离株的系统研究，明确了主要的耐药机制：主要序列类型ST52经常携带GyrA（S83F/Y）和ParC（S80R）的双重突变。这些突变直接导致了高度的氟喹诺酮耐药性（Lan等人，2025年）。疫苗是预防M. bovis感染的另一种关键策略。提高疫苗疗效的主要挑战在于细菌菌株的适应性变异。具体而言，体外培养条件（如培养基成分、温度和pH值）会选择更适应实验室环境的变体。与野外分离株相比，实验室适应的菌株在连续传代后通常表现出更高的Myc/Cell比率（Yacoub等人，2025年）。更重要的是，实验室条件下的连续传代可能会改变菌株在分离时的原始病理生理特性。鉴于这种细菌能够快速适应环境变化并调节其毒性，从实验室适应的菌株开发的疫苗往往对实际遇到的遗传多样性的野外菌株保护效果不佳。全基因组分析能够在物种水平上描述病原体的遗传特征，从而克服了依赖单一参考菌株无法捕捉物种全部遗传多样性的局限性（Tettelin H等人，2005年）。同时，反向疫苗学有助于预测潜在的疫苗靶点，包括低丰度抗原。这些方法的结合拓宽了新抗原发现的范围和深度，为加速疫苗开发并提高安全性和疗效带来了巨大希望。
在这项研究中，我们对来自不同地理区域且毒力特征各异的M. bovis菌株进行了全基因组分析，以鉴定保守的核心基因和潜在的共同抗原。通过结合反向疫苗学和免疫信息学方法，我们评估了抗原的免疫原性并迅速缩小了候选靶点范围。选定的蛋白质使用E. coli重组表达系统进行了表达，用于亚单位疫苗的开发。最后，通过动物实验评估了重组蛋白的免疫原性和安全性。本研究为开发M. bovis亚单位疫苗提供了科学基础和候选靶点，有助于改善全球对M. bovis相关感染的防控。
章节片段
M. bovis基因组数据的收集与全基因组分析
从NCBI数据库中检索了2010年至2024年期间的80个完整的M. bovis基因组序列。使用IPGA工具包进行了全基因组分析，该工具包整合了OrthoFinder、OrthoMCL、Panaroo、PanOCT、PanX、PPanGGOLiN和Roary等软件来鉴定核心蛋白。过滤阈值设置为95%的完整性和5%的污染率，其他参数保持默认设置（Liu等人，2022年）。
M. bovis菌株的分布
使用关键词“Mycoplasma bovis”从NCBI数据库中检索并整理了M. bovis的完整基因组序列。共有80个基因组符合纳入标准并被选为后续分析对象，平均完整性为96%。这些基因组序列是在大约15年内提交的，而相应的细菌菌株是在超过60年的时间内分离出来的。这些菌株具有广泛的地理多样性，涵盖了亚洲、欧洲等地。讨论
M. bovis已成为全球养牛业的主要威胁，疾病控制变得越来越困难。该病原体具有高度传染性，能够感染牛、野牛、鹿、山羊等多种物种，并在不同宿主中表现出不同的组织嗜性（Kumar等人，2020年）。虽然M. bovis感染是一个多因素过程，但黏附是定植和疾病建立的关键初始步骤。已有多种与黏附相关的蛋白质被研究
结论
M. bovis是导致牛呼吸道疾病的主要病原体，给全球养牛业造成了巨大的经济损失。为了克服传统疫苗和抗生素疗法的局限性，我们对80个地理分布广泛的菌株进行了全基因组分析，并系统地定义了保守的核心基因集。通过结合反向疫苗学和免疫信息学方法，我们确定了三个高度保守的候选抗原——LplA、LepA和
CRediT作者贡献声明
Jun Qiao：撰写——审稿与编辑、监督、资源管理、项目协调、资金获取、概念构思。Jiaming Mu：撰写——初稿撰写、验证、方法学设计、数据管理、概念构思。Zhongmei Ma：监督、方法学设计。Qingling Meng：资源管理、项目协调、资金获取。Xuepeng Cai：项目协调、资金获取。Jie Li：监督、方法学设计。
伦理声明
所有动物实验均获得了石河子大学生物伦理委员会的批准，并按照委员会的建议进行（A2025–960）。
资助
本研究得到了国家重点研发计划（编号：2016YFD0500900）和中国国际科技合作计划（编号：2014DFR31310）的支持。
利益冲突声明
本手稿未在其他地方接受发表。本手稿的发表已获得所有作者的同意，以及相关工作开展地的主管机构的明确或默示批准。如果被接受，该文章不得以相同的形式或任何其他语言（包括电子形式）在其他地方发表，未经版权持有者的书面同意。作者声明不存在任何利益冲突。
致谢
我们感谢为本研究提供技术支持的所有工作人员。
