《Water Cycle》：Modification of microalgae-based toxicity assessment by continuously updating the tested solution: taking sulfonamide toxicity as an example
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本文提出了一种改良的微藻毒性评估方法，通过在检测系统中持续供给新鲜污染物（磺胺类抗生素），模拟自然环境中的持续污染状态。研究以小球藻（Chlorella vulgaris）为受试生物，发现相较于传统一次性添加法，新方法下三种磺胺类药物对微藻5-7天生长的抑制/促进作用更显著，证明传统方法可能低估抗生素毒性。基于此，文章还设计了一套推流式装置蓝图，用于评估抗生素及其在不同处理过程中产生的中间产物的毒性，为优化污染物去除技术提供了新视角。
1. 引言
磺胺类药物（SAs）是常见的广谱抗菌剂，主要用于治疗和预防各种细菌或病原微生物感染以及促进动物生长。然而，SAs不能被人体和其他动物完全代谢，导致大量残留抗生素及其代谢物通过多种途径进入水环境。尽管水中磺胺类药物的浓度通常在μg/L至mg/L范围，但它们会影响微生物群落的结构和功能，诱导抗生素抗性基因的产生，影响氮、碳和硫的循环，最终对人类健康和生态系统的可持续发展构成潜在威胁。因此，评估环境浓度下磺胺类药物的毒性不容忽视。
自然环境中的水体通过点源和非点源受到污染。这种污染物排放是一个持续的过程，使得环境中的污染物浓度保持相对恒定。然而，在大多数生物毒性评估实验中，污染物通常是一次性添加的，并随着时间的推移与生物体发生相互作用。微藻通常用于测定磺胺类药物的慢性或急性毒性。在毒性检测过程中，微藻可以降解磺胺类药物并产生中间产物，导致溶液组成与初始状态不同。因此，很难确定磺胺类药物在特定水平下的急性毒性。传统的生物毒性测试是否会低估抗生素毒性仍属未知。此外，中间产物的毒性水平与其母体磺胺类药物不同，且成分复杂，难以彼此分离。母体磺胺类药物及其中间产物的毒性可以通过几种基于构效关系的软件工具进行预测，而通过实验进行直接表征则难以实现。
由于传统的检测结果可能无法反映自然水体的污染状态，因此在整个检测过程中持续更新抗生素溶液，而不是在开始时一次性全部加入，可能更为合适。因此，本研究旨在提出一种通过持续更新抗生素溶液以保持恒定抗生素浓度的生物毒性评估方法，验证传统的生物毒性测试是否会低估抗生素毒性，并为测量母体抗生素及其中间产物的毒性提供新的视角。
2. 材料与方法
2.1. 微藻物种
选择微藻普通小球藻（Chlorella vulgaris FACHB-416）作为毒性评估的目标生物。将装有150 mL BG11培养基的锥形瓶在121°C高压灭菌锅中灭菌。然后将50 mL小球藻接种到BG11培养基中，在25°C（±0.5°C）的培养箱中培养7天，使其达到具有高活性的对数生长期。光照由LED灯提供，光强为4000 lx，光暗比为12 h:12 h。制备活性小球藻（初始藻密度为5~8.5×106cells/mL）用于正式毒性实验。
2.2. 实验设置
新的毒性测定模式如图所示。将小球藻接种到玻璃容器中，在实验组中通过蠕动泵以6 mL/min的流速持续添加含有5 mg/L抗生素的测试溶液，以模拟实验中持续污染的状态。添加过滤装置以将藻类保留在系统中，同时排出处理过的抗生素溶液。在对照组中，抗生素溶液被纯水取代，其他操作条件与实验组保持一致。为了与传统生物毒性评估方法的结果进行比较，另外设置了两个系统，分别一次性添加5 mg/L抗生素（实验组）和纯水（对照组）。这四个系统分别被指定为连续更新加抗生素（C-A）、连续更新不加抗生素（C-N）、一次性添加加抗生素（O-A）和一次性添加不加抗生素（O-N）。依次检测了三种常用的磺胺类药物（即磺胺甲恶唑、磺胺嘧啶和磺胺二甲嘧啶）。微藻短期毒性测试通常在5至7天内进行。因此，在第5天和第7天使用血球计数板在光学显微镜下测量四个系统中的藻类密度，以评估藻类生长情况。
2.3. 微藻生物量计算方法
使用公式(2.1)中描述的特定生长比率（r）来描述微藻在5~7天培养期间的生长速率。由于普通小球藻的初始接种密度在不同实验批次中无法完全保持一致，因此选择r而非最终藻密度，以尽量减少因初始细胞计数差异引起的误差。无抗生素（N）组和有抗生素（A）组之间的特定生长比率差异（定义为Δr）按公式(2.2)计算。Δr直接量化了抗生素的抑制或刺激效应，其大小反映了对微藻生长影响的程度。正值表示抗生素对微藻生长有抑制作用，负值表示抗生素对微藻生长有刺激作用。差异值越高，表示抗生素对微藻的影响越大。
其中，r指微藻的生长比率；Nt指第t天的藻密度（cells/mL）；N0指初始藻密度（cells/mL）；Δr指特定生长比率的差值；rN指无抗生素反应器（C-N或O-N）的特定生长比率；rA指含抗生素反应器（C-A或O-A）的特定生长比率。
2.4. 数据分析与统计
根据磺胺类药物的类型（磺胺甲恶唑、磺胺嘧啶和磺胺二甲嘧啶）进行了三组实验，每组重复三次（n=3）。通过一致检测方案获得的同一藻密度样品的多次重复测量结果呈正态分布且方差齐性。因此，采用t检验来测试不同组之间的一致性，这也常用于验证类似实验设置中三次重复样品的可重复性。
3. 结果与讨论
3.1. 不同抗生素添加方式下的微藻生长
普通小球藻的初始接种密度在不同实验批次中无法保持完全相同。因此，与最终藻密度（cells/mL）项目相比，生长比率（r）更适合规避因每组初始接种量略有不同而引起的误差。抗生素对微藻的生长具有抑制/促进作用，这可以通过图2中的Δr项目反映出来。在抗生素的影响下，微藻的生长表现出两种状态。一方面，一些抗生素可以与废水中的营养物质一起通过微藻的共代谢等过程被共同降解，而微藻主要利用常规碳源进行生长。在某些情况下，这个过程甚至可能因抗生素的存在而受到刺激。这解释了为什么磺胺甲恶唑（SMX）对微藻生长显示出促进作用。另一方面，抗生素的存在刺激了微藻中活性氧的积累。这种积累（包括单线态氧、超氧化物自由基、过氧化氢和羟基自由基）通过阻碍从PSII到PSI或ATP合酶的电位通道来阻碍ATP的合成，导致微藻线粒体和叶绿体中的能量转换受到抑制，从而阻碍光合作用和代谢过程，限制微藻的生长。这解释了为什么磺胺二甲嘧啶（SM2）和磺胺嘧啶（SDZ）对微藻生长表现出抑制作用。
在本研究中，所有实验组在0、3、5和7天测量了藻密度。观察到毒性在5到7天之间开始显现，这一时期与文献中报道的类似毒性评估的时期一致。此外，对于含有SMX、SDZ和SM2的C（连续更新）组，第5天的Δr分别为0.11 ± 0.08、0.48 ± 0.01和-0.08 ± 0.05。对于不含SMX、SDZ和SM2的O（一次性添加）组，第5天的Δr分别为-0.03 ± 0.04、0.23 ± 0.01和-0.45 ± 0.02。第7天的Δr在C组和O组之间显示出相同的趋势。可以得出结论，在5~7天时，与O组相比，磺胺类药物在C组中总是对微藻表现出更大的抑制或更小的促进作用（P<0.05）。C-A组中的微藻持续暴露在相对较高浓度的抗生素中。然而，O-A组中的污染物是一次性添加的，导致抗生素浓度随着生物降解过程而降低。此外，磺胺类药物的中间产物的毒性通常低于母体化合物。因此，C-A组中的抗生素会比O-A组中的抗生素更强地抑制微藻。这一结果也说明，持续更新测试溶液为毒性评估生物提供了相对稳定的水质，比传统方法更接近地模拟了污染物的自然状态，并且可以获得更准确的毒性结果。传统方法可能会低估抗生素的毒性。
3.2. 用于抗生素及其中间产物的毒性测定装置
基于上述结果，并受推流反应的启发，提出了一种毒性装置，用于模拟相对恒定的污染条件，并准确评估抗生素及其通过各种处理过程（如高级氧化、光催化和微生物降解）产生的中间产物的毒性。该装置的配置如图所示。该装置可分为反应室和平行测试室。在反应室中，污染物溶液连续不断地从入口提供。可以连续注入臭氧或紫外光，并且可以将微生物、活性污泥或光催化材料水平固定在反应室底部，以模拟不同的处理过程。一旦系统稳定，处理过程中不同中间产物的时间进程可以通过它们在反应室长度方向上的空间分布来呈现。因此，在等距离处提供了一系列低流量分支出口，以将差异化的抗生素溶液（含有不同的中间产物）提供给生物体进行毒性测定。初始点和后续点可以分别反映母体抗生素和不同反应阶段中间产物的毒性。此外，测试生物体不限于微藻，该装置可以扩展到其他污染物（例如重金属、农药、多环芳烃）或反应过程（例如光催化、高级氧化、微生物降解）的毒性评估。值得注意的是，不同污染物的理化性质（例如降解动力学、吸附亲和力、疏水性）可能会调节该方法的有效性。例如，对微藻生物质具有高吸附能力的污染物可能表现出增强的截留效率，而降解速率缓慢的顽固化合物可能需要调整水力停留时间以确保充分的毒性评估。然而，连续更新模式的核心优势是在时间尺度上或在特定空间点保持稳定的污染物浓度，从而能够准确反映毒性。它有利于在特定浓度下对化学品进行准确的毒性评估，确定毒性沿处理过程的变化而非间接模拟计算，并指导优化处理技术及其去除污染物和毒性的关键参数。
4. 结论
在本研究中，开发了一种新的毒性评估方法，其中持续向生物体提供新鲜的磺胺类药物以进行毒性评估，以模拟自然界中的持续污染。与本研究提出的方法（微藻以恒定浓度接触新鲜抗生素）相比，涉及微藻和抗生素一次性混合的传统生物毒性测试低估了抗生素毒性。本研究也为直接测量不同处理过程中抗生素及其中间产物的毒性提供了视角，从而指导优化处理技术及其去除污染物和毒性的关键参数。
