《Pharmaceutical Biology》：Phytochemical study of Homalanthus giganteus: isolation, antiproliferative activity, and computational mechanistic insights of tigliane diterpenes against colorectal cancer
编辑推荐：
本研究首次对巨大假桐（Homalanthus giganteus）进行植物化学研究，分离鉴定出两个大戟二萜（tigliane diterpenes）和四个三萜类化合物。其中，化合物4（12-O-palmitoyl-7-oxo-5-ene-phorbol-13-acetate）对结直肠癌细胞系（Colo 205和Colo 320）显示出最强的抗增殖活性。结合密度泛函理论（DFT）、网络药理学和分子对接分析，研究揭示了化合物4通过稳定化学结构及靶向激酶（PRKCA/GSK3β）发挥作用，具有良好的药代动力学（ADME）和安全前景，为该植物作为新型结直肠癌（colorectal cancer, CRC）药物先导来源提供了首个机制性证据。
绪论
结直肠癌是全球第三大常见癌症，也是第二大癌症死亡原因。晚期诊断、转移性病例的不良预后以及多药耐药性的出现，凸显了对新疗法的迫切需求。天然产物，特别是大戟科（Euphorbiaceae）植物，因其结构多样的萜类化合物（尤其是二萜）而成为抗癌药物发现的重要来源。巨大假桐（Homalanthus giganteus Zoll. ex Miq.）是大戟科下的一个小属，此前对其植物化学和药理活性研究甚少。本研究旨在从其叶片中分离生物活性化合物，评估它们对结直肠癌细胞的抗增殖作用，并通过多种计算工具阐明其潜在作用机制。
实验方法
1. 化合物分离与鉴定
研究人员收集了印度尼西亚龙目岛的新鲜巨大假桐叶片，经干燥、研磨后，用甲醇进行渗滤提取，得到粗提物。随后采用离心分配色谱（CPC）、开放柱色谱（OCC）、真空液相色谱（VLC）、旋转平面色谱（RPC）和高效液相色谱（HPLC）等多种色谱技术进行分离纯化。所得化合物的结构通过核磁共振（NMR）和高分辨电喷雾电离质谱（HRESIMS）进行鉴定。
2. 抗增殖活性测定
分离得到的化合物对人结直肠腺癌细胞系Colo 205（多柔比星敏感）和Colo 320（多药耐药，表达P-gp）进行抗增殖活性测试。采用MTT法测定细胞活力，计算半数抑制浓度（IC50），并以多柔比星作为阳性对照。
3. 密度泛函理论（DFT）计算
为了从电子层面理解化合物活性差异，使用ORCA 6.1.0软件对两个主要二萜化合物（3和4）进行DFT计算。分析内容包括前线分子轨道（HOMO和LUMO）、分子静电势（MEP）图谱，并计算了化学硬度（η）、化学软度（S）、电负性（χ）、化学势（μ）和亲电指数（ω）等全球化学反应性描述符。
4. 网络药理学与分子对接
通过网络药理学方法预测化合物的潜在靶点。将化合物的SMILES输入Swiss Target Prediction数据库，筛选出与结直肠癌相关的基因靶点。利用STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，并通过Cytoscape进行拓扑分析以确定核心靶点（hub target）。最后，使用AutoDock Vina对化合物与核心靶点蛋白（STAT3、JUN、PRKCA、GSK3β）进行分子对接模拟，评估结合亲和力与相互作用模式。
5. 药代动力学与毒理学预测
使用pkCSM在线服务器，基于化合物的SMILES预测其吸收、分布、代谢、排泄（ADME）性质及毒性特征。
结果
1. 分离得到的化合物
研究共分离得到六个化合物，均首次从巨大假桐中报道：7β-羟基谷甾醇（1）、7α-羟基谷甾醇（2）、12-O-棕榈酰基佛波醇-13-乙酸酯（3）、12-O-棕榈酰基-7-羰基-5-烯-佛波醇-13-乙酸酯（4）、Cerevisterol（5）和β-谷甾醇-3-O-葡萄糖苷（6）。它们的结构通过NMR和HRESIMS数据与文献比对得以确证。化合物3和4属于大戟二萜类。
2. 抗增殖活性
抗增殖实验结果显示，二萜类化合物（3和4）的活性显著高于三萜类化合物。其中，化合物4的活性最强，对Colo 205和Colo 320细胞的IC50值分别为3.58 ± 0.37 μM和6.06 ± 1.70 μM，比化合物3的活性高出3.5至5.0倍。化合物1（7β-羟基谷甾醇）的活性优于其异构体2（7α-羟基谷甾醇）。有趣的是，化合物6（β-谷甾醇-3-O-葡萄糖苷）对耐药细胞系Colo 320的活性反而更强（耐药因子RF = 0.45），暗示其可能具有耐药修饰作用。
3. DFT计算分析
DFT计算为化合物4的更高活性提供了物化层面的解释。化合物4具有更高的HOMO-LUMO能隙（5.236 eV）和化学硬度（2.618 eV），表明其分子结构比化合物3（能隙4.756 eV）更稳定，反应性更低。化合物3较高的亲电指数（3.875 eV）可能反映了其较高的化学反应性，但这种反应性可能导致其在生物环境中发生非特异性反应或降解，从而削弱其特异性靶向作用和生物活性。分子静电势图谱显示，化合物4因C-7位羰基的存在，形成了独特的静电环境，这可能影响其与靶蛋白的相互作用。
4. 网络药理学与作用机制
网络药理学预测发现，化合物3和4共同作用于43个与结直肠癌相关的靶点。这些靶点中，激酶类占比最高（46.7%）。蛋白互作网络和拓扑分析确定了四个核心靶点：STAT3、JUN、PRKCA（蛋白激酶Cα）和GSK3β（糖原合成酶激酶3β）。KEGG通路富集分析表明，这些靶点显著富集于“癌症通路”、“胰岛素抵抗”、“钙信号通路”和“cAMP信号通路”等与癌症发生发展密切相关的路径。基因本体分析显示，“钙依赖性蛋白激酶C活性”和“信号转导调控”是最相关的分子功能与生物过程。
5. 分子对接验证
分子对接结果与抗增殖活性高度吻合，并揭示了不同的作用模式。活性更强的化合物4对激酶靶点PRKCA和GSK3β表现出更高的结合亲和力（结合能分别为-5.10 kcal/mol和-4.16 kcal/mol）。在PRKCA的结合口袋中，化合物4形成了关键的π-烷基相互作用和与Asn 468的氢键，并避免了与Glu 387的不利相互作用，这可能是其结合更优的原因。而活性较弱的化合物3则倾向于结合转录因子STAT3和JUN。激酶的抑制能更快速地影响细胞信号传导和增殖，这解释了为何在72小时的MTT实验中，化合物4表现出更强的即时细胞毒性。
6. 药代动力学与毒性预测
pkCSM预测表明，两个二萜化合物均表现出良好的口服生物利用度潜力，肠道吸收率分别为79.4%（3）和74.6%（4）。它们都是P-糖蛋白的底物和抑制剂，且主要经CYP3A4代谢。两者对中枢神经系统的渗透性均很低（血脑屏障穿透系数log BB为负值），这降低了产生神经毒副作用的潜在风险。毒性预测显示，两者均无致突变性（AMES阴性），急性口服毒性和肝毒性风险也在可接受范围内。
讨论与结论
本研究首次对巨大假桐进行了系统的植物化学研究，成功分离并鉴定出六种化合物，包括两个具有显著抗结肠癌活性的大戟二萜。研究揭示了化合物4（12-O-棕榈酰基-7-羰基-5-烯-佛波醇-13-乙酸酯）是其中最具潜力的先导化合物。其卓越的活性源于更稳定的分子结构（由DFT证实）以及对关键激酶靶点（PRKCA和GSK3β）的优先结合能力（由分子对接证实）。网络药理学进一步揭示了其通过多靶点、多通路发挥抗癌作用的潜在机制。初步的药代动力学预测也支持其具有可开发的药物特性。
综上所述，巨大假桐是发现新型抗结直肠癌先导化合物的一个有前景的来源。化合物4通过靶向激酶通路展现出高效且可能克服部分耐药性的抗增殖活性。这些发现为该植物的进一步开发和利用提供了重要的植物化学与机制依据。当然，网络药理学和分子对接的预测结果仍需后续的体外和体内实验验证，并且鉴于大戟二萜类化合物已知的肿瘤促进风险，对其进行全面、深入的毒理学评估至关重要。
