《Pharmaceutical Biology》：lncRNA MALAT1-mediated regulation of cholesterol-oxidative stress-iron metabolic dysregulation by paeoniflorin in osteoarthritic chondrocytes
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本文系统阐述了芍药苷（Pae）通过靶向长链非编码RNA MALAT1，调控骨关节炎（OA）软骨细胞内胆固醇代谢、氧化应激及铁死亡三大病理环节的作用机制。研究发现，MALAT1的高表达会加剧OA中胆固醇代谢紊乱、氧化应激及铁超载，而Pae能有效抑制MALAT1，恢复关键代谢通路蛋白（如ABCA1、SREBP、GPX4）的表达平衡，从而改善软骨破坏并减轻细胞凋亡，为OA治疗提供了新的分子靶点和潜在药物。
芍药苷通过调节lncRNA MALAT1改善骨关节炎软骨细胞中胆固醇-氧化应激-铁代谢失调
研究背景与目的
骨关节炎（Osteoarthritis, OA）是一种以关节软骨退行性变、炎症和代谢失调为特征的慢性疾病。目前常规疗法如镇痛药、非甾体抗炎药和关节置换术在促进软骨修复方面效果有限。近年研究表明，长链非编码RNA MALAT1在OA进程中扮演关键角色，其表达上调与肥胖相关性OA的代谢紊乱密切相关。肥胖是OA的重要风险因素，脂质代谢异常会加速OA进展。此外，微环境稳态在OA中的作用日益受到关注，其中氧化应激是关键治疗靶点。铁死亡（Ferroptosis）作为一种与脂质代谢和氧化应激密切相关的程序性细胞死亡方式，也与OA进程相关。胆固醇代谢失调可直接触发细胞内氧化应激，而过度氧化应激又会进一步驱动铁死亡，这三者可能构成了一个连续的代谢调控轴，共同导致软骨细胞功能障碍。
芍药苷（Paeoniflorin, Pae）是从中药白芍中提取的一种主要活性成分，具有强大的免疫调节、抗炎和抗氧化活性。在软骨细胞中，Pae能抑制活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）产生、减少细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）降解和软骨酶分泌、降低细胞凋亡，从而提供软骨保护作用。本研究旨在探讨Pae是否能通过调节lncRNA MALAT1，缓解OA软骨细胞中的胆固醇-氧化应激-铁代谢失调，并阐明其相关分子机制。
材料与方法
本研究整合了体内（小鼠）和体外（细胞）实验。在体内研究中，采用改良Hulth手术法构建小鼠OA模型，随后通过关节腔内注射MALAT1过表达质粒。实验动物随机分为空白组、模型组、模型+Pae组、模型+oe-MALAT1组及模型+oe-MALAT1+Pae组。模型+Pae组每日灌胃给予芍药苷（100 mg/kg），持续4周。通过组织学染色（HE、番红O-固绿、甲苯胺蓝、Masson染色）评估软骨形态，并采用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）、蛋白免疫印迹（Western blot）及总铁含量测定等方法检测相关基因与蛋白的表达。
在体外研究中，使用白细胞介素-1β（Interleukin-1β, IL-1β）刺激软骨细胞构建OA模型，并通过慢病毒转染实现MALAT1的敲低（sh-MALAT1）。采用荧光原位杂交（Fluorescence In Situ Hybridization, FISH）检测软骨细胞中MALAT1的表达，利用Western blot和流式细胞术（Flow Cytometry）评估Pae对相关蛋白表达及细胞凋亡率的影响。
结果
Pae对OA小鼠关节软骨的保护作用
组织形态学染色结果显示，模型组小鼠软骨层结构破坏严重，出现不连续、基质降解及软骨细胞暴露。相比之下，Pae干预组（模型+Pae组）软骨结构得以较好保存。即便在过表达MALAT1的条件下（模型+oe-MALAT1+Pae组），Pae仍能改善软骨层的结构完整性，显示出其保护作用。
Pae调节软骨组织中lncRNA MALAT1及相关代谢基因的表达
实时荧光定量PCR结果显示，与空白组相比，模型组软骨组织中lncRNA MALAT1、CHOP、iNOS和ACSL4的表达显著上调，而胆固醇逆向转运蛋白ABCA1的表达显著下调。Pae治疗后，能显著逆转这些异常表达：降低MALAT1、CHOP、iNOS和ACSL4的水平，并上调ABCA1的表达。然而，当同时过表达MALAT1时，Pae的有益效果被部分抵消，表明MALAT1过表达会减弱Pae的调节作用。
Pae改善OA软骨组织中相关蛋白的表达
Western blot分析显示，模型组软骨组织中ABCA1和谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）的表达显著降低，而固醇调节元件结合蛋白（SREBP）、细胞色素P450家族成员7B1（CYP7B1）、CHOP、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、环氧化酶-2（COX2）和长链脂酰辅酶A合成酶4（ACSL4）的蛋白水平显著升高。Pae干预后，这些变化被逆转：ABCA1和GPX4表达上调，而SREBP、CYP7B1、CHOP、iNOS、COX2和ACSL4表达下调。同样，MALAT1过表达会削弱Pae对这些蛋白的调节作用。
Pae减轻OA软骨组织中的总铁积累
总铁含量测定结果表明，模型组小鼠骨组织中的总铁水平显著高于空白组。Pae干预后，总铁水平显著降低。然而，在同时过表达MALAT1并给予Pae的组别中，总铁水平又显著回升，进一步证实了MALAT1在铁代谢调控中的关键作用。
Pae抑制IL-1β诱导的软骨细胞中lncRNA MALAT1的表达
体外FISH分析显示，IL-1β刺激显著增加了软骨细胞中lncRNA MALAT1的拷贝数，表现为强烈的绿色荧光信号。而Pae处理则显著降低了MALAT1的表达，荧光强度明显减弱。
敲低lncRNA MALAT1影响Pae处理的IL-1β诱导软骨细胞中相关基因的表达
实时荧光定量PCR分析发现，在敲低MALAT1的IL-1β诱导软骨细胞中，Pae干预能进一步抑制MALAT1、CHOP、iNOS和ACSL4的表达，并显著上调ABCA1的表达。这表明Pae对OA代谢相关基因的调节作用与MALAT1的功能密切相关。
Pae通过介导lncRNA MALAT1改善OA胆固醇-氧化应激-铁代谢失调
Western blot分析进一步验证，在MALAT1敲低条件下，Pae能显著上调ABCA1和GPX4蛋白水平，同时下调SREBP、CYP7B1、CHOP、iNOS、COX2和ACSL4的表达。这些结果共同证明，MALAT1主动参与了OA胆固醇-氧化应激-铁代谢通路，而Pae正是通过调节这一MALAT1依赖的机制发挥保护作用。
Pae抑制IL-1β诱导的软骨细胞凋亡
流式细胞术分析表明，IL-1β处理显著增加了软骨细胞的凋亡率。Pae干预能显著降低细胞凋亡，而当lncRNA MALAT1被沉默时，这种保护作用进一步增强。这证实了Pae可以通过调控lncRNA MALAT1的表达水平来减少软骨细胞凋亡。
讨论
本研究结果揭示了lncRNA MALAT1在OA病理中的核心地位。MALAT1的高表达通过驱动胆固醇稳态失调、氧化应激和铁超载，加剧软骨细胞的代谢功能障碍。芍药苷（Pae）作为一种有效的干预剂，能够逆转这些病理改变。其作用机制涉及多个层面：首先，Pae下调MALAT1的表达；其次，通过调节MALAT1，Pae恢复了胆固醇代谢关键蛋白（如ABCA1、SREBP、CYP7B1）的平衡，改善了脂质代谢；第三，Pae上调了抗铁死亡的关键蛋白GPX4，并下调了促铁死亡蛋白ACSL4，从而抑制了铁死亡过程；第四，Pae降低了氧化应激相关蛋白（CHOP、iNOS、COX2）的表达，减轻了氧化损伤；最终，这些通路的协同作用保护了软骨细胞，减少了细胞凋亡，延缓了软骨退化。
结论
综上所述，本研究阐明了芍药苷（Pae）通过靶向lncRNA MALAT1，调节胆固醇-氧化应激-铁代谢轴，从而改善骨关节炎软骨退变的分子机制。这不仅为理解OA的复杂病理生理网络提供了新的视角，也为开发以MALAT1为靶点、调节代谢平衡的OA治疗新策略奠定了重要的实验基础。未来的研究需要在人源软骨细胞或临床样本中进一步验证这些发现，以评估其转化医学潜力。
