《Plant Signaling & Behavior》：Proteomic analysis may explain differences in Citrus?×?limon and Citrus?×?sinensis susceptibility to Trioza erytreae
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本研究通过蛋白组学对比了柑桔木虱（Trioza erytreae， HLB 传播媒介）偏好的寄主柠檬（Citrus × limon 'Eureka'）与常见寄主甜橙（C. × sinensis 'Valencia'）在受木虱若虫侵染后的响应差异。研究发现在甜橙中若虫发育成功率低，且其维管液蛋白组发生显著改变（鉴定出1265个差异丰度蛋白，显著多于柠檬的48个），涉及光合作用相关蛋白下调及防御相关通路的激活。这表明甜橙能启动更强、更广泛的防御反应，而柠檬反应较弱，可能解释了木虱对其的偏好性。
1 引言
黄龙病（Huanglongbing， HLB）是全球最具破坏性的柑桔病害之一，主要由韧皮部限制性细菌Candidatus Liberibacter spp.引起，其传播媒介包括非洲柑桔木虱（Trioza erytreae）。地中海盆地作为全球重要柑桔产区，尽管目前尚无HLB，但T. erytreae已在伊比利亚半岛扩散。该木虱对不同寄主的偏好性差异显著，其中柠檬（Citrus × limon）是其最偏好寄主，甜橙（C. × sinensis）则为常见寄主，但偏好性的分子机制尚不清楚。
嫩梢对T. erytreae的产卵和若虫发育至关重要。研究认为，柠檬植株新梢生长周期及其叶片释放的挥发性化合物（柠檬烯、桧烯、β-罗勒烯）是木虱偏好该寄主的主要因素。汁液取食性昆虫与寄主的相互作用是一个复杂过程，会改变植物的代谢并区分易感和抗性基因型。维管系统是木虱与寄主之间信号交流的重要场所，特别是在若虫定居发育阶段。本研究旨在通过蛋白组学比较柠檬（'Eureka'品种）与甜橙（'Valencia'品种）在受T. erytreae若虫侵染后的维管液蛋白组响应，以揭示寄主偏好背后的分子机制。
2 材料与方法
2.1 植物材料 研究使用了32株柑桔植株，包括16株'Valencia'甜橙和16株'Eureka'柠檬，均嫁接在Carrizo枳橙砧木上。植株按相同批次获得，拥有植物检疫护照，被归类为“认证”级别。试验期间，植株置于人工混合基质中，在气候室内标准条件下培养。
2.2 昆虫来源与饲养 T. erytreae成虫和若虫采自葡萄牙Porto地区无农药柠檬园。经PCR检测，所采集昆虫及植物样品中均未发现Candidatus Liberibacter spp.。采集的成虫在柠檬和酸橙植株上建立种群，并在可控气候室中饲养。
2.3 侵染与若虫发育 使用性成熟的成年木虱侵染甜橙和柠檬植株。每个物种有8株植株被侵染（EurekaLemonInf和ValenciaSwOInf），另有8株作为对照（EurekaLemonCon和ValenciaSwOCon）。每株植株用10只成虫（5雄5雌）侵染，并隔离在网罩内。在侵染后23至25天，统计每株植株的虫瘿和若虫（四龄和五龄）数量。
2.4 柑桔维管液蛋白提取与蛋白谱分析 在若虫发育至四龄或五龄时，分别从侵染和对照植株采集嫩叶及其叶柄。采用改进的离心法从叶片和叶柄中脉提取富含维管液蛋白的样品，此方法能富集维管液和质外体液，但也可能包含邻近叶脉薄壁细胞、伴细胞和叶肉细胞的内容物，因此所得提取物称为“富集维管液”。提取的总蛋白通过Bradford法测定浓度，并通过SDS-PAGE评估质量。
2.5 柑桔富集维管液蛋白组学分析
2.5.1 蛋白组学数据采集 将样品酶解后，通过纳升级液相色谱-串联质谱（nanoLC-MS/MS）进行分析，数据采集由Xcalibur软件控制。
2.5.2 数据分析、蛋白质无标记定量与鉴定 使用Proteome Discoverer软件处理原始质谱数据，在甜橙（taxon ID 2711）的UniProt蛋白质序列数据库中进行检索鉴定。蛋白质无标记定量在Minora节点进行。
2.5.3 生物信息学分析 计算侵染组与对照组之间的蛋白质丰度倍数变化。利用拟南芥（Arabidopsis thaliana）同源物对差异丰度蛋白（Differentially Abundant Proteins， DAPs）进行功能分析，并使用KEGG数据库进行通路富集分析。
2.6 统计分析 使用Student’s t检验比较侵染植株间的平均若虫和虫瘿数量。通过主成分分析（Principal Component Analysis， PCA）评估蛋白组数据。DAPs的确定基于预设的丰度变化和统计显著性阈值。
3 结果
3.1 T. erytreae若虫在'Eureka'柠檬上的发育优于'Valencia'甜橙
侵染后，'Eureka'柠檬和'Valencia'甜橙植株上的若虫均能发育并形成虫瘿。值得注意的是，大量受侵染的甜橙叶片在次生和三级叶脉处出现颜色加深的现象，而这种症状在受侵染的柠檬叶片中很少见，在对照植株叶片中则完全没有。虽然两寄主植株上的平均虫瘿数量无显著差异（柠檬330.1 ± 47.5 SEM， 甜橙246.8 ± 30.8 SEM），但成功发育的若虫数量存在显著差异（p < 0.05）。柠檬植株上的平均若虫数量（318.5 ± 47.3）是甜橙植株（99.3 ± 27.6）的三倍以上。
3.2 若虫侵染诱导'Valencia'甜橙发生比'Eureka'柠檬更大的蛋白组变化
共鉴定出5050个蛋白质。经过滤后，得到用于比较的蛋白质库：柠檬3141个，甜橙3370个。比较侵染与对照植株，在柠檬中鉴定出48个DAPs（22个上调，26个下调），而在甜橙中鉴定出1265个DAPs（964个上调，301个下调），表明甜橙的蛋白组对侵染的响应调整更为剧烈。两寄主共有18个DAPs，其中9个在两物种中均上调，4个均下调，其余5个在柠檬中下调而在甜橙中上调。主成分分析显示，无论是使用所有鉴定蛋白还是仅用DAPs，侵染植株与对照植株均能沿第一主成分轴清晰分离，表明T. erytreae侵染影响了富集维管液蛋白组。
3.3 功能分析
通过KEGG通路富集分析，揭示了三种类型的响应模式：
3.3.1 T. erytreae若虫诱导两种柑桔寄主的共同响应 两种寄主共有4条显著富集的通路。其中“半乳糖代谢”、“维生素B6代谢”和“硒化合物代谢”通路上调，“氨基糖和核苷酸糖代谢”通路下调。
3.3.2 在响应T. erytreae时，'Eureka'柠檬与'Valencia'甜橙在蛋白质生物合成相关通路上存在相反的调控 有4条共同富集的通路表现出相反的调控模式：它们在柠檬中下调，在甜橙中上调。这些通路包括“剪接体”、“mRNA监测通路”、“内质网中的蛋白质加工”（与蛋白质生物合成相关）以及“泛酸和辅酶A（CoA）生物合成”。
3.3.3 'Eureka'柠檬响应T. erytreae的两条特异性通路 仅在柠檬侵染组中，有两条通路被独特富集且下调：“硫代谢”和“倍半萜和三萜生物合成”。
3.3.4 'Valencia'甜橙植株对T. erytreae侵染的响应调整范围更广、程度更深 甜橙侵染组中显著富集的通路数量（86条）远多于柠檬（10条），其中58条上调，28条下调。上调的通路涉及生物合成、代谢、蛋白质合成与加工以及防御响应（如“α-亚麻酸代谢”、“植物-病原体互作”）。下调的通路则主要与代谢、降解和碳固定相关（如“光合生物中的碳固定”、“光呼吸”）。特别值得注意的是，与呼吸相关的代谢通路（“糖酵解/糖异生”、“丙酮酸代谢”、“柠檬酸循环”）上调，而光合作用相关通路下调。
4 讨论
4.1 T. erytreae若虫在'Eureka'柠檬上的发育优于'Valencia'甜橙
甜橙植株上发育的若虫数量显著减少，同时叶片叶脉颜色加深，表明甜橙寄主的响应可能对若虫发育产生了不利影响。两寄主间虫瘿数量相似，但若虫存活率不同，暗示甜橙可能启动了某种防御机制，影响了若虫后期存活。
4.2 若虫侵染诱导'Valencia'甜橙发生比'Eureka'柠檬更大的蛋白组变化
甜橙中DAPs数量远超柠檬，表明其对木虱侵染的蛋白组重编程更为广泛和剧烈。这种剧烈的防御响应重编程可能是柠檬作为偏好寄主、若虫发育更成功的原因之一。相反，柠檬与木虱的互作可能激活了蛋白组学方法未涵盖的其他响应，或者通过诱导水杨酸（SA）途径来抑制JA和乙烯防御途径的完全激活。
4.3 功能分析
4.3.1 T. erytreae若虫诱导两种柑桔寄主的共同响应 共同上调的“半乳糖代谢”和“维生素B6代谢”通路可能与植物抗氧化胁迫响应以及木虱作为额外的“养分库”有关，因为昆虫自身无法合成B族维生素，且木虱可能摄入半乳糖。共同下调的“氨基糖和核苷酸糖代谢”则与韧皮部取食者导致的植物氨基酸平衡调整一致。
4.3.2 在响应T. erytreae时，'Eureka'柠檬与'Valencia'甜橙在蛋白质生物合成相关通路上存在相反的调控 甜橙中蛋白质生物合成相关通路的普遍上调，反映了其因应激而增强的蛋白质合成速率，以产生更多应激相关蛋白。柠檬中这些通路的下调或无变化，突显了两寄主响应策略的差异。
4.3.3 两条特异性下调的'Eureka'柠檬通路 “硫代谢”的下调可能与木虱偏好柠檬有关，因为硫代谢在植物防御中起关键作用。其下调可能与“硒化合物代谢”的上调存在竞争关系。“倍半萜和三萜生物合成”通路的下调也暗示了柠檬防御反应的独特性。
4.3.4 'Valencia'甜橙植株对T. erytreae侵染的响应调整范围更广、程度更深 甜橙激活了广泛的防御调整，包括：JA信号通路相关蛋白（如LOX2， AOC3）的上调，表明启动了针对昆虫取食的典型防御反应；呼吸作用增强与光合作用减弱，这是植物应对胁迫的普遍模式；以及“植物-病原体互作”通路的上调，涉及过敏性反应相关蛋白激酶（如MPK3， MPK4， CPK6， CPK9），表明甜橙可能启动了类似抗病反应的防御机制。这些综合的、强烈的蛋白组调整共同作用，可能破坏了维管液营养成分，或产生了不利若虫发育的防御化合物，从而阻碍了T. erytreae若虫的发育。
5 结论
本研究通过对受T. erytreae若虫侵染的柠檬和甜橙富集维管液蛋白组的深入分析，揭示了寄主特异性响应的分子基础。甜橙表现出剧烈的蛋白组重编程，涉及防御、代谢和蛋白质合成的广泛调整，特别是激活了JA信号通路和类似过敏性反应的防御机制，同时抑制了光合作用。这些强烈的防御反应可能使其成为木虱较不适宜的寄主。相比之下，柠檬的蛋白组响应较弱，尤其是硫代谢的下调，可能部分解释了木虱对其的偏好性。该研究为理解木虱-柑桔互作提供了新的蛋白组学视角，并指出了进一步研究其寄主选择机制的新方向。
