《Prion》：Efficient induction of motor neuron disease in transgenic G93A SOD1 mice by prion-like seeding
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本研究通过实验证实，在成年（可达12月龄）低表达G93A-SOD1（VLE G93A SOD1）小鼠中，鞘内注射含有错误折叠G93A或G85R SOD1的种子匀浆，可高效诱导运动神经元疾病的加速发生。这揭示了接种途径和年龄是影响SOD1种子诱导疾病效率的关键因素，支持了错误折叠SOD1的朊病毒样模板化特性在SOD1-ALS（肌萎缩侧索硬化症）疾病进展中的作用。
引言
家族性肌萎缩侧索硬化症（ALS）可由编码抗氧化酶Cu/Zn超氧化物歧化酶-1（SOD1）的基因突变引起。这些突变导致SOD1蛋白构象改变，使其错误折叠并聚集，形成病理包涵体。G93A是研究广泛的ALS致病SOD1突变之一。高表达G93A-SOD1的Gur1小鼠会在大约4-6月龄自发瘫痪。有趣的是，ALS具有类似朊病毒的扩散特性，即病理蛋白的“播种”效应能加速疾病进程。先前研究表明，表达G85R SOD1变异体的小鼠在注射瘫痪G85R小鼠的脊髓匀浆后，瘫痪会显著加速。然而，高表达G93A-SOD1的Gur1小鼠对来自瘫痪G93A小鼠的匀浆“种子”有抵抗性，而一个表达水平极低的G93A小鼠品系（VLE G93A-SOD1）虽然对种子有反应，但效率低下。这引发了一个关键问题：如果朊病毒样传播对SOD1-ALS发病机制至关重要，为何G93A-SOD1小鼠对播种的易感性如此差？既往研究多将种子匀浆注射到新生小鼠脊柱，这促使研究者思考，年龄更大的G93A SOD1小鼠是否对播种更敏感？
研究结果
通过鞘内注射在G85R-SOD1:YFP小鼠中确定播种效率
本研究首先比较了新生小鼠椎管内注射（ISP）和成年小鼠鞘内注射两种途径的播种效率。实验使用表达G85R-SOD1:YFP的Line 230小鼠。结果发现，鞘内注射种子匀浆在诱导加速瘫痪方面与新生期ISP注射同样有效。所有接受鞘内注射的2月龄Line 230小鼠均在接种后约1.8个月内瘫痪，且均表现出明显的SOD1包涵体病理，通过直接荧光和Campbell–Switzer银染法均可检测到。这表明鞘内注射是一种研究SOD1朊病毒样种子特性的有效实验范式。
通过鞘内注射SOD1种子匀浆高效诱导VLE G93A-SOD1小鼠早期瘫痪
基于鞘内注射的有效性，研究团队测试了成年VLE G93A-SOD1小鼠对朊病毒样种子的易感性。实验首先确认，未接受种子注射的VLE G93A-SOD1小鼠即使饲养至20月龄也不会出现瘫痪症状，为测试不同年龄接种提供了时间窗口。研究设计了多组实验，用不同的种子匀浆（来自瘫痪的Gur1 G93A-SOD1小鼠、传代后的G93A种子池[P2 G93A池]、以及从未接触过G93A种子的瘫痪G85R-SOD1:YFP小鼠匀浆[230池]）在不同年龄（新生、2月龄、6月龄、12月龄）对VLE G93A-SOD1小鼠进行鞘内或ISP注射。
结果令人振奋：12月龄VLE G93A-SOD1小鼠在鞘内注射G93A种子匀浆后，8只中有7只在接种后6-10个月内瘫痪。注射P2 G93A池种子匀浆后，不仅12月龄小鼠，连新生、2月龄和6月龄的小鼠也表现出高达90%的瘫痪诱导率。更关键的是，从未接触过G93A种子的G85R-SOD1种子匀浆（230池）同样能高效诱导12月龄VLE G93A-SOD1小鼠瘫痪。统计分析显示，接种途径、接种年龄和种子来源均显著影响瘫痪的潜伏期。这些发现共同证明，年轻和年长的VLE G93A-SOD1小鼠都容易受到含有错误折叠G93A-SOD1或G85R-SOD1匀浆的播种影响，且两者之间存在高效的交叉播种。
鞘内播种诱导瘫痪的VLE G93A-SOD1小鼠具有典型的包涵体病理
对瘫痪小鼠的神经病理学检查证实了SOD1包涵体病理的存在。使用Campbell–Switzer银染法和泛素（ubiquitin）免疫染色均显示，所有被种子诱导瘫痪的VLE G93A-SOD1小鼠脊髓中，病理包涵体水平均显著高于未瘫痪的对照小鼠。这些包涵体多为散布在神经纤维网中的小斑点，部分区域可见类似丝状的结构，表明树突或轴突内充满了G93A-SOD1聚集体。这些病理特征在所有接受不同类型种子匀浆注射的瘫痪小鼠中均相似，进一步确认了通过注射错误折叠SOD1种子匀浆在成年VLE G93A-SOD1小鼠中成功诱导了运动神经元疾病（MND）。
讨论与结论
本研究首次将G85R-SOD1来源的ALS“朊病毒”株引入G93A-SOD1小鼠，并发现了高效的交叉播种证据。研究结果表明，表达低水平突变SOD1的VLE G93A-SOD1亚系小鼠，对来自瘫痪的Gur1 G93A-SOD1小鼠和G85R-SOD1:YFP小鼠的脊髓匀浆播种是易感的。基于当前数据，我们得出结论：注射途径和引入ALS致病构象的年龄，能显著影响SOD1 ALS“朊病毒”的播种效率。G85R-SOD1 ALS“朊病毒”可通过多种途径高效播种，但其他SOD1变体（如G93A）的播种效率可能因递送途径而异。总而言之，本研究的核心发现是：人源SOD1的G93A变异体能够支持并传播源于瘫痪的突变SOD1小鼠体内的、导致ALS的“朊病毒”构象。这项工作为了解SOD1-ALS的发病机制，特别是病理蛋白在细胞间扩散的“朊病毒样”特性，提供了重要的实验依据。
研究方法概要
研究所用转基因小鼠包括VLE G93A-SOD1小鼠和G85R-SOD1:YFP小鼠（Line 230）。种子匀浆从瘫痪小鼠的脊髓组织制备。新生小鼠采用椎管内注射（ISP），成年小鼠采用鞘内注射。主要的人道终点是至少一条后肢出现明显瘫痪。神经病理学分析包括直接荧光成像、Campbell–Switzer银染和泛素免疫组织化学染色。实验设计流程图清晰展示了不同种子匀浆的来源和实验分组。统计数据采用对数正态Brown–Forsythe和Welch方差分析（ANOVA）及Dunnett多重比较检验进行分析。
