缺氧是实体瘤微环境的关键特征，严重限制了自然杀伤（NK）细胞疗法的效果。本研究揭示了缺氧会损害NK细胞线粒体功能，削弱其细胞毒性，而靶向线粒体分裂动力相关蛋白1（DRP1）——无论是通过药物抑制还是CRISPR-Cas9敲除（DRP1KO）——都能有效恢复其线粒体完整性与抗肿瘤活性。特别是，工程化改造的DRP1KO嵌合抗原受体（CAR）NK细胞在缺氧条件下依然保持强大的杀伤力，为克服实体瘤免疫治疗障碍提供了新颖的代谢工程策略。
中文标题
克服实体瘤缺氧：靶向DRP1恢复自然杀伤细胞功能的新策略
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本综述聚焦于自然杀伤（NK）细胞在实体瘤缺氧微环境中功能受损的核心问题，揭示了线粒体分裂关键蛋白DRP1的重要作用。研究表明，通过药理学或基因工程手段（如CRISPR-Cas9）抑制DRP1，能有效维持NK细胞的线粒体稳态，并恢复其嵌合抗原受体（CAR）工程化后的细胞毒性，为增强实体瘤免疫治疗疗效提供了新的代谢干预靶点。
引言
细胞与基因疗法正在彻底改变癌症的治疗方式。虽然嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法在治疗晚期白血病和淋巴瘤方面取得了显著成功，但其在实体瘤中的应用面临更大挑战。高达90%的成人癌症为实体瘤，其预后通常较差。实体瘤的肿瘤微环境（TME）复杂，具有营养匮乏、高酸性和缺氧等免疫抑制特征，这使得浸润的免疫细胞（包括T细胞和自然杀伤细胞）功能受损。自然杀伤（NK）细胞作为先天免疫系统的细胞毒性细胞，具有无需预先致敏即可快速识别和清除肿瘤细胞的独特优势，且安全性更佳，具备同种异体治疗的潜力。然而，实体瘤TME中的缺氧成为了NK细胞疗法有效性的主要障碍。缺氧源于癌细胞的快速增殖、代谢改变以及紊乱的血管系统，导致氧气分压陡降。临床上，缺氧与多种实体瘤的不良预后相关，并严重影响包括NK细胞疗法在内的免疫治疗效果。因此，理解缺氧如何塑造NK细胞生物学对于优化其在实体癌中的免疫治疗应用至关重要。
免疫细胞的代谢远不止于ATP生成和生物合成，需要协调的代谢途径来支持特定的效应功能。线粒体已成为NK细胞代谢和适应性的关键调节器，其结构深刻影响NK细胞在癌症和慢性感染中的反应。功能失调的NK细胞通常表现为小型、碎片化的线粒体，这突显了线粒体动力学作为潜在代谢干预靶点的重要性。胞质GTP酶动力相关蛋白1（DRP1）是线粒体分裂的主要介导者。在细胞压力下，失调的DRP1活性会促进过度的线粒体碎片化、线粒体功能障碍、活性氧（ROS）水平升高和细胞适应性的丧失。这些特征表明，调节DRP1依赖的线粒体动力学可能恢复NK细胞在缺氧肿瘤微环境中的功能。
本研究旨在探究缺氧对NK细胞（包括细胞因子武装的第四代CAR NK细胞）的影响，证实缺氧损害NK细胞线粒体功能和细胞毒性效应潜力，并验证基因敲除DRP1能否在代谢压力下保护NK细胞功能。
结果
1. 缺氧损害NK细胞细胞毒性效应潜力并与线粒体功能障碍相关
为理解低氧如何改变NK细胞代谢和细胞毒性，研究采用1% O2培养NK细胞48小时以模拟TME缺氧水平。结果显示，缺氧显著削弱了NK细胞对K562靶细胞的杀伤活性。在代谢层面，缺氧暴露48小时后，NK细胞的总线粒体含量显著减少，而细胞体积未变。线粒体膜电位（线粒体活性的指标）显著降低，同时线粒体ROS水平强烈升高，这些均指向缺氧培养引起的线粒体应激。
RNA测序分析揭示了缺氧NK细胞独特的转录谱。与预期一致，缺氧暴露的NK细胞表现出缺氧标志基因的显著富集。相反，与mTORC1信号、干扰素反应和氧化磷酸化相关的基因显著下调，而线粒体动力学和监测基因上调。mTORC1信号在调节NK细胞代谢和效应功能中起核心作用，干扰素反应对于免疫监视和细胞毒性至关重要。氧化磷酸化相关基因的下调与观察到的线粒体含量和膜电位降低一致。上调的“线粒体动力学和监测”转录特征突出了缺氧NK细胞中的线粒体应激反应，其特点是调控分裂、融合、凋亡和线粒体自噬的基因表达增加。此外，缺氧NK细胞显示出抗氧化活性降低的趋势，这与观察到的线粒体ROS增加相符。
功能代谢分析（SCENITH?）显示，缺氧导致对照组细胞中嘌呤霉素MFI降低约4.5倍，表明全局蛋白质翻译（及ATP产生）受到显著抑制。尽管未达统计学显著性，但缺氧下糖酵解能力和葡萄糖依赖性增加，而线粒体依赖性降低，这反映了缺氧条件下以牺牲线粒体呼吸为代价的糖酵解适应。这些观察表明，缺氧给NK细胞带来了显著的代谢和生存压力，导致线粒体功能障碍和功能损伤。
2. 细胞因子武装的CAR工程未能恢复缺氧下的NK细胞功能
尽管NK细胞具有内在的抗肿瘤活性，但通常需要细胞因子武装的CAR工程来最大化抗癌疗效，特别是在实体瘤中，通过增强靶向特异性和持久性。研究先前表明，IL-15与CD70导向的CAR共表达能够在体外和体内对血液和实体瘤模型产生强大的抗肿瘤活性。由于已知IL-15支持NK细胞代谢适应性，研究探讨了这些CAR工程细胞是否能抵御缺氧应激。
通过分析癌症基因组图谱数据，评估了多种肿瘤类型的缺氧程度。许多肿瘤类型表现出升高的缺氧评分。基于TCGA数据和选定肿瘤实体已确立的缺氧微环境，研究选择了具有代表性的肿瘤细胞系面板用于体外建模。
研究生成了CD70-CAR-IL-15 NK细胞，并证实了所有三种靶癌细胞系上CD70的高表面表达。在共培养前，将CAR NK细胞在常氧或缺氧条件下预处理48小时。结果显示，缺氧显著降低了CD70-CAR-IL-15 NK细胞介导的对所有靶细胞的杀伤。抑制作用在Raji和HeLa细胞中最为显著，而对Panc-1细胞的影响较为温和。这些结果表明，即使在IL-15的支持下，缺氧也会对血液和实体瘤细胞系中抗原特异性CAR NK细胞的功能产生抑制作用。
3. DRP1调节减轻缺氧的不利影响
鉴于缺氧损害线粒体含量和功能，同时增强线粒体动力学，且CD70-CAR-IL-15工程未能恢复细胞毒性，研究接下来探究了抑制分裂因子DRP1能否减轻NK细胞功能障碍。研究使用了DRP1抑制剂Mdivi-1。通过Mdivi-1处理阻断该分裂因子，确实恢复了缺氧下对K562的杀伤，并防止了线粒体含量的损失。然而，该小分子的特异性受到质疑，且其临床应用因缺乏安全性数据而受限。
为克服这些限制，研究利用CRISPR-Cas9技术实现了DRP1基因的稳定敲除。通过使用预组装的Cas9蛋白和靶向外显子4的多向导RNA策略，实现了高且持久的敲除效率，并通过流式细胞术证实DRP1KONK细胞的磷酸化DRP1水平显著降低。重要的是，DRP1缺失保持了NK细胞与野生型对照相当的增殖速率。因此，尽管DRP1与缺氧诱导的NK细胞线粒体和功能损伤有关，但其缺失并不损害细胞活力或增殖能力。
4. DRP1KONK细胞在缺氧下表现出改善的线粒体韧性特征
首先评估了DRP1KO细胞在缺氧下的线粒体占有率。DRP1KONK细胞在缺氧条件下保持了线粒体完整性，其线粒体占有率维持在与常氧相当的水平。线粒体膜电位在缺氧下保持稳定，而线粒体ROS水平在缺氧下仍然升高。
接下来研究了DRP1KO细胞在缺氧和常氧条件下的转录和代谢谱。基因表达谱和排名前位的上、下调标志通路与常氧 vs 缺氧条件下的DRP1WT细胞相似，MIR142HG和BAX仍然是缺氧DRP1KONK细胞中上调最强的基因。然而，mTORC1标志通路和线粒体动力学特征是显著的例外。mTORC1通路在缺氧DRP1WTNK细胞中下调，但在相同条件下的DRP1KO细胞中似乎未改变。考虑到mTORC1在NK细胞效应功能中的作用，这可能预示着杀伤能力的保持。此外，虽然线粒体动力学特征在DRP1WTNK细胞中显著上调，但在DRP1KONK细胞中情况并非如此，这与未改变的线粒体负荷一致。抗氧化活性的基因特征在缺氧下有下调趋势，与观察到的线粒体ROS水平升高一致，类似于DRP1WTNK细胞。
为确定DRP1缺失是否改变NK细胞对缺氧的代谢反应，研究对在常氧和缺氧条件下培养的DRP1KO细胞进行了SCENITH?分析。与野生型细胞相似，DRP1KONK细胞在缺氧下显示出翻译和ATP产生的减少。有趣的是，尽管RNA-seq数据显示OXPHOS相关基因下调，但SCENITH?显示缺氧下线粒体依赖性增加，这与在DRP1KO细胞中观察到的线粒体膜电位和线粒体含量得以保持一致。总体而言，DRP1KONK细胞在缺氧条件下保持了线粒体含量、膜电位和mTORC1信号，支持了其抵抗缺氧诱导功能障碍的潜力。
5. DRP1KOCAR NK细胞在缺氧下保留其细胞毒性效应潜力
为评估DRP1KONK细胞保持的线粒体完整性是否转化为改善的效应功能，研究对这些细胞进行了改造，使其表达CD70-CAR-IL-15构建体，并在缺氧条件下评估了它们的细胞毒性潜力。DRP1KOCAR NK细胞在所有三种测试的肿瘤细胞系中都保持了强大的细胞毒性效应功能，与常氧相比，在缺氧下未见损伤。
为进一步在更生理相关的背景下评估其功能，研究建立了由胰腺导管腺癌患者来源类器官与CD70+癌症相关成纤维细胞组成的3D微肿瘤模型。该模型更好地复现了TME的细胞复杂性，并允许评估患者特异性反应。在三个测试患者样本中的一个中，DRP1KOCAR NK细胞显著降低了绿色CAF信号，而DRP1WTCAR NK细胞和无NK对照组则无此效果。在来自另外两名患者的微肿瘤中，未观察到对DRP1WT和DRP1KOCAR NK细胞反应的显著差异，其中一名患者表现出耐药性，另一名表现出敏感性。
为探究不同患者的微肿瘤为何对CAR NK细胞反应不同，研究对患者来源类器官进行了RNA测序，以识别与CAR NK细胞活性相关的独特转录肿瘤程序。患者1的类器官显示上皮信号、缺氧和炎症应激以及TGF-β信号和上皮-间质转化的富集，反映了一种TGF-β高、EMT偏向的表型，这可能解释了对DRP1WT和DRP1KOCAR NK细胞的完全耐药。患者2的类器官显示出增殖性和凋亡应激特征，以及TGF-β/EMT特征，反映了一种应激的肿瘤状态，与强大的基础NK细胞活性一致。患者3的类器官表现出强烈的糖酵解和代谢、增殖应激以及缺氧和炎症程序，定义了一种缺氧适应、糖酵解表型。虽然这些微肿瘤对DRP1WTNK细胞具有耐药性，但能被DRP1KONK细胞有效靶向，突显了其对缺氧应激的韧性。这些发现表明，患者来源类器官的转录状态定义了微肿瘤对CAR NK细胞的耐药模式，突显了在评估NK细胞疗法时患者变异性的重要性。
讨论
缺氧是实体瘤的标志，已知会损害包括NK细胞在内的免疫细胞功能。与早期发现一致，本研究表明暴露于低氧水平会导致NK细胞细胞毒性降低。这种损伤也在用CD70靶向CAR和自分泌IL-15改造的NK细胞中观察到。虽然CAR策略和细胞因子支持通常能增强NK细胞功能，但证明不足以完全抵消缺氧诱导的功能障碍。因此，这些数据强调需要直接解决缺氧TME所施加的代谢限制的策略。
线粒体是细胞代谢和免疫细胞命运的关键调节器。它们不断经历分裂和融合，重塑其结构。由DRP1和FIS1介导的分裂促进线粒体自噬、ROS产生、凋亡和细胞增殖。由MFN1、MFN2和OPA1控制的融合形成管状网络，增强氧化磷酸化，增加Ca2?流，并保护细胞免受应激。在人类肿瘤的缺氧区域，肿瘤浸润NK细胞表现出DRP1活化增加，这由持续的mTOR信号驱动。这导致线粒体碎片化、线粒体极化减少、线粒体ROS增加和细胞毒性受损，本研究的结果也证实了这一点。
鉴于这一背景，以及缺氧NK细胞中线粒体代谢和含量的深刻变化，研究探讨了靶向DRP1是否能保护NK细胞功能。研究结果表明，用Mdivi-1进行DRP1的药理抑制恢复了线粒体缺陷和细胞毒性。然而，出于对Mdivi-1特异性和患者安全性的担忧，研究使用CRISPR-Cas9技术产生了稳定的DRP1KONK细胞。DRP1KONK细胞在常氧下正常增殖，并在缺氧下保持细胞毒性潜力和线粒体含量。
尽管存在功能差异，但DRP1KO和DRP1WTNK细胞在缺氧下显示出相似的转录谱。这可能部分反映了用于RNA-seq的较短缺氧暴露时间，该时间选择是为了确保高质量的转录组数据，与功能测定中使用的48小时暴露时间形成对比。一个显著的转录差异是mTORC1信号的行为。虽然该通路在缺氧DRP1WT细胞中下调，但在DRP1KO细胞中基本保持不变。NK细胞的细胞因子刺激导致mTOR活化，这是代谢和功能反应所必需的。在许多细胞类型中，缺氧会抑制mTORC1信号，通常涉及应激反应通路。虽然转录组数据符合这一普遍模式，但与先前研究中关于缺氧条件下NK细胞mTORC1激活增加的报道形成对比。造成这种差异的因素可能包括细胞类型、缺氧持续时间、培养条件以及评估mTORC1活性的特定读数差异。尽管RNA-seq仅提供mTORC1信号的间接视图，但在具有高mTORC1活性的细胞中观察到了已建立的mTORC1反应性转录程序。在此背景下，在缺氧下观察到的保持的mTORC1相关转录输出可能有助于NK细胞功能的维持。
实体瘤中的氧气可用性高度异质，范围从坏死核心内的近缺氧条件到侵袭边缘的轻度缺氧。研究使用慢性1% O2来研究强烈且持续的肿瘤缺氧对NK细胞线粒体生物学和效应功能的有害影响。由于体外缺氧暴露是静态的，研究纳入了PDAC患者来源的3D微肿瘤来近似空间氧气梯度和结构复杂性。患者来源类器官之间的转录异质性强烈预测了微肿瘤模型中CAF对CAR NK细胞的反应。患者1表现出TGF-β/EMT和上皮-缺氧程序的富集，这是免疫排斥PDAC状态的特征。TGF-β信号是肌成纤维样CAF分化、细胞外基质沉积和直接NK细胞抑制的核心驱动因素，为观察到的完全耐药性提供了机制依据。患者2类器官显示出增殖和凋亡应激程序，这是一种与应激配体表达增加和颗粒酶介导的细胞毒性易感性增强相关的转录状态，推测导致了CAR NK细胞细胞毒性更许可的环境。患者3类器官显示出强烈的糖酵解和缺氧特征，这些已知会通过乳酸积累、酸中毒和营养竞争产生代谢抑制微环境，损害免疫效应细胞的线粒体功能。这些条件选择性地使对缺氧诱导的线粒体碎片化敏感的DRP1WTNK细胞失活，但被DRP1KONK细胞克服，后者在缺氧应激下保持线粒体适应性。这些关联依赖于类器官转录数据，但支持了NK细胞线粒体动力学和适应性的重要性，这两者都决定了免疫细胞的命运和功能。这些发现表明，肿瘤内在程序在决定CAR NK细胞疗效方面起着决定性作用，突显了将NK细胞工程策略与患者定义的耐药状态相匹配的重要性。尽管患者来源的体外模型允许纳入这种患者异质性，但它们缺乏动态的氧气循环和完整的基质多样性。因此，最终需要相关的体内模型来进行具有转化目的的细胞疗法研究。总体而言，肿瘤氧气限制在设汁能够在患者肿瘤内和肿瘤间的异质性中始终如一地发挥作用的细胞疗法方面，提出了额外的挑战。
总之，研究结果表明缺氧对NK细胞代谢和功能产生广泛影响，这无法通过细胞因子武装的CAR完全挽救。数据还表明，线粒体动力学是这一现象的核心，在NK细胞中破坏DRP1可以在缺氧下保护线粒体功能和细胞毒性效应功能。这种线粒体调节可能是CAR NK细胞在实体癌中有效发挥作用所必需的。
