《Redox Report》：Prophylactic quercetin administration attenuates pulmonary fibrosis via ferroptosis-resistant priming of alveolar epithelial cells
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本研究首次揭示了天然黄酮类化合物槲皮素（Quercetin, QUE）作为特发性肺纤维化（IPF）潜在预防剂的机制。研究通过博来霉素（BLM）诱导的小鼠和肺泡上皮细胞IPF模型，对比了预防性（仅BLM攻击前）与治疗性（仅BLM攻击后）给药的效果。研究发现，预防性给QUE能够在损伤后达到与治疗相当的纤维化减轻效果，同时更有效地抑制肺泡上皮损伤、铁死亡（ferroptosis）和衰老的峰值。其核心机制在于QUE能在健康肺泡上皮细胞中触发一种适度的适应性氧化应激（ROS轻度升高），这不会损害细胞基本功能，却能通过激活14-3-3γ介导的NRF2磷酸化与核转位，持续上调GSH和GPx4水平，从而建立细胞的铁死亡抗性（ferroptosis-resistant）状态，最终限制纤维化发生。该研究将QUE的功能拓展为一种“抗氧化疫苗”，为IPF的高危人群预防策略提供了全新的理论基础和实验依据。
摘要
特发性肺纤维化（IPF）是一种致死性间质性肺病，死亡率高，生存期短，临床治疗以延缓疾病进展为主，预防策略关注不足。本研究旨在探究天然黄酮类化合物槲皮素（QUE）对IPF的预防潜力及其机制。研究建立了博来霉素（BLM）诱导的小鼠和肺泡上皮细胞IPF模型，设置了两个独立的给药窗口：预防性给药（仅在BLM攻击前）和治疗性给药（仅在BLM攻击后）。研究结果揭示，预防性给QUE不仅能达到与治疗后给药相当的抗纤维化效果，还能更有效地抑制肺泡上皮损伤、铁死亡和衰老的峰值。预防性方案还能加速GSH和GPx4水平的恢复。机制上，QUE在健康肺泡上皮细胞中触发了一种适应性应激，表现为ROS轻度升高和氧化应激响应通路激活。这种应激对健康细胞的活力、增殖、克隆形成、凋亡或衰老影响甚微。相反，它通过14-3-3γ介导的磷酸化增强了NRF2的核转位，从而驱动GSH和GPx4的持续升高，赋予细胞铁死亡抗性，进而限制纤维化发生。关键性实验发现，共施用Mito-TEMPO或Z-VAD-FMK可抑制QUE诱导的ROS，但同时会消除其对BLM损伤的预防作用，证实了通过适应性应激进行的“预适应”是QUE预防作用的核心机制。这些发现揭示了QUE作为一种有前景的IPF预防剂，其作用机制是通过肺泡上皮细胞的预适应来增强铁死亡抗性。
1. 引言
IPF的病因不明，但普遍认为是肺泡上皮反复损伤的结果。持续损伤会损害肺泡祖细胞的分化和再生能力，并同时触发TGF-β等促纤维化介质的分泌，从而导致肌成纤维细胞异常活化和上皮细胞向纤维化表型转化。IPF患者支气管肺泡灌洗液（BALF）中脂质过氧化产物水平升高，支持了铁死亡在纤维化肺的细胞损伤中起重要作用。相应地，铁死亡与肺中的上皮-间质转化（EMT）和成纤维细胞-肌成纤维细胞转化过程密切相关。因此，增强肺泡上皮细胞的铁死亡抗性是预防IPF的一个有前景的策略。槲皮素（QUE）是一种天然黄酮类化合物，因其强大的抗氧化、抗炎和清除衰老细胞活性，已成为多种呼吸系统疾病有潜力的治疗剂。然而，既往研究大多将QUE作为与肺损伤同时或之后给药的“治疗剂”进行评估，而非作为“预防性”措施。本研究旨在探究QUE的预防潜力，以诱导具有铁死亡抗性的肺上皮稳态并保护其免受促纤维化损伤。
2. 材料与方法
研究使用雌性C57BL/6小鼠和肺泡上皮细胞系（MLE-12）以及原代人气道上皮细胞（HAECs）。动物实验分为四组：正常对照组、BLM模型组、预防组（QUE + BLM）和治疗组（BLM + QUE）。预防组小鼠在BLM暴露前4周每日腹腔注射QUE，并在BLM攻击后停止给药。治疗组小鼠在BLM造模后第7天开始每日给予QUE，直至实验结束。体外细胞实验中，也设置了相应的预防性和治疗性给药方案。通过多种技术评估了纤维化程度、细胞损伤、氧化应激、铁死亡和衰老等指标，包括组织学染色（Masson染色、天狼星红染色、免疫组化/免疫荧光）、Western blot、ELISA、RNA测序（RNA-seq）、流式细胞术以及各类生化试剂盒检测（羟脯氨酸、GSH/GSSG、MDA、4-HNE、Fe2+等）。
3. 结果
3.1. 预防性QUE给药减轻BLM诱导的肺纤维化
在小鼠中，预防性给QUE（BLM攻击前4周开始，攻击后停止）能显著减轻BLM诱导的体重下降、肺组织羟脯氨酸水平升高以及肺纤维化（Masson和天狼星红染色显示）。同时，QUE预防性干预显著降低了肺组织中TGF-β、Col I和α-SMA在蛋白和mRNA水平的表达。其抗纤维化效果与BLM损伤后开始给药的“治疗性”干预相当。此外，高表达α-SMA的纤维化肺实质区域常缺乏表达SPC的肺泡II型细胞，这与IPF源于肺泡损伤的经典观点一致。
3.2. 预防性QUE给药增强对BLM诱导的铁死亡和衰老的抗性
BLM攻击后出现严重的肺泡上皮损伤，表现为肺泡I型（AT1）和II型（AT2）细胞大量耗竭。QUE预防显著减少了BLM后第7天AT1和AT2的丢失，且这种保护作用持续到第28天。相比之下，QUE治疗组小鼠在第7天经历了更严重的上皮损伤，直到第28天才部分恢复。BLM诱导的急性肺泡损伤与氧化应激和铁死亡有关。本研究发现，QUE预防在BLM后第7天就显著减轻了肺组织ROS水平以及关键铁死亡标志物（PTGS2、Fe2+、MDA、4-HNE）的升高，并增强了GSH/GSSG比值。这些保护作用持续到第28天。虽然QUE治疗在第28天也能类似地减轻ROS和大多数铁死亡标志物，但它未能恢复GPx4水平或GSH/GSSG比值，表明抗氧化防御系统的恢复效率较低。BLM诱导的损伤还加速了肺泡上皮衰老。QUE预防在第7天就显著减轻了衰老标志物（p21、IL-6、IL-1β、TNF-α）的升高，并有效维持了抗炎因子IL-10的水平。这些数据表明，QUE预防通过增强肺泡上皮对BLM诱导的铁死亡和衰老的抗性，从而减轻肺纤维化的发展。
3.3. QUE对健康细胞的预防效应并非主要通过清除衰老细胞介导
在非衰老的对照细胞中，QUE仅引起最小的凋亡细胞数、caspase-3活化以及Bcl-2和Bax表达的变化，对衰老细胞流行率或衰老标志物p16和p21的表达影响甚微。这与QUE在辐射诱导的衰老细胞中观察到的显著促凋亡和清除衰老细胞效应形成对比。然而，QUE预处理显著减轻了BLM在非衰老细胞中诱导的细胞活力变化和LDH释放。这些数据表明，QUE对BLM损伤的预防效应不太可能是通过清除罕见的衰老细胞介导的，而是源于对占主导地位的健康细胞群体的直接预防机制。
3.4. QUE预防赋予肺泡上皮细胞铁死亡抗性状态
RNA-seq分析显示，QUE预处理的MLE-12细胞中，氧化应激响应通路被激活。与此一致，观察到ROS水平中度升高（这与QUE在衰老细胞中的ROS清除作用相反）。然而，这种应激反应可能是适应性的，因为它并未对细胞形态、活力、群体倍增时间、克隆形成效率、凋亡或衰老产生有害影响。此外，转录组分析揭示了QUE诱导的NRF2转录活性和GSH代谢上调，以及GSH转移酶和过氧化物酶活性增加。这在QUE预处理的MLE-12细胞中GSH水平升高和GSH/GSSG比值增加得到证实。考虑到QUE赋予铁死亡抗性的作用，这些发现共同指向铁死亡抑制因子GPx4，它利用GSH来解毒细胞毒性脂质过氧化物，并受NRF2转录调控。与此机制一致，研究证实了QUE预处理的MLE-12细胞中GSH含量以及GPx4在mRNA和蛋白水平的上调。关键的是，在QUE预防的小鼠肺中，GSH和GPX4的升高在QUE停药后可持续4周，这表明这是一种不依赖于持续QUE暴露的持续生理状态。
3.5. QUE诱导的适应性应激对其预防效应至关重要
为验证QUE诱导的应激与其对BLM损伤的预防效应之间的因果关系，用抗氧化剂Mito-TEMPO与QUE共处理MLE-12细胞。Mito-TEMPO有效减弱了QUE诱导的ROS，但同时消除了GSH和GPx4水平的增加，并损害了QUE的预防效应。鉴于QUE通过干扰抗凋亡/促生存通路诱导衰老细胞凋亡，推测其在健康非衰老肺泡细胞中也有类似相互作用。然而，在这些细胞中，QUE仅引发有限的应激，因为它们本身对抗凋亡通路的生存依赖较低。支持这一点的是，凋亡抑制剂Z-VAD-FMK与QUE共处理同样减少了ROS诱导，并消除了GSH和GPx4水平的增加，其对BLM损伤的预防损害程度与Mito-TEMPO相当。此外，用H2O2预处理MLE-12细胞直接验证了ROS介导的保护作用。中等剂量的H2O2（20 μM）产生的ROS水平与QUE相当，也能对随后的BLM攻击提供部分保护。而过高（100 μM）或不足（4 μM）的H2O2则无法提供保护。
3.6. QUE的预防机制依赖于14-3-3γ
研究发现，BLM暴露的小鼠肺中同时出现了14-3-3γ和GPx4水平的下降。在细胞水平，BLM以剂量和时间依赖的方式降低了MLE-12细胞中14-3-3γ的表达。QUE预防上调了MLE-12细胞中14-3-3γ的表达，并防止了其受BLM诱导的下降。功能缺失研究表明，敲低MLE-12细胞中的14-3-3γ显著降低了GPx4水平，而用RSL3药物抑制GPx4则未显著改变14-3-3γ的表达。这些数据表明14-3-3γ位于GPx4的上游，对其调控至关重要。QUE预防增强了NRF2的磷酸化和核积累，并伴随着胞质水平的降低。关键的是，这种QUE诱导的NRF2磷酸化和核转位在14-3-3γ沉默的细胞中被消除。
3.7. QUE预防赋予14-3-3γ依赖性的BLM诱导的铁死亡、衰老和纤维化表型减轻
BLM在MLE-12细胞中诱导的铁死亡表现为GPx4表达显著降低，铁死亡标志物（PTGS2、Fe2+、MDA、4-HNE）水平升高，ROS/脂质ROS水平升高，以及GSH/GSSG平衡被破坏。这些铁死亡变化在用QUE预处理或用铁死亡抑制剂Fer-1处理的细胞中得到显著缓解。至关重要的是，这种预防效应在14-3-3γ沉默后被消除，强调了14-3-3γ在介导QUE预防效应中不可或缺的作用。此外，BLM攻击显著上调了MLE-12细胞中的衰老标志物（p21和IL-1β）和纤维化标志物（TGF-β1、α-SMA和Col I）。Fer-1处理有效减轻了这些衰老和纤维化变化，暗示它们与铁死亡相关。QUE预防同样抑制了这些变化。一致的是，QUE预防的抗衰老和抗纤维化效应也在14-3-3γ沉默后显著受损。
3.8. 预防性与治疗性QUE干预对BLM攻击的肺泡上皮细胞的比较
体外比较显示，QUE预防和QUE治疗均能显著提高细胞活力并减少LDH释放，两种策略之间无统计学显著差异。然而，RNA-seq分析揭示，在经受BLM攻击的MLE-12细胞中，两种QUE干预后的转录组谱相似，但存在细微差异。GO和WikiPathways富集分析表明，氧化应激响应、NRF2转录活性和GSH代谢通路在QUE预防的细胞中优先上调。与此一致，QUE预防能有效恢复BLM损伤后MLE-12细胞中14-3-3γ、GPx4和GSH的生理水平，而QUE治疗则效果较弱。相比之下，QUE治疗上调了涉及类二十烷酸脂质合成、铁氧化酶活性、TGF-β信号传导和肺纤维化通路的基因。这些发现表明，通过QUE治疗从BLM攻击中恢复的肺泡上皮细胞呈现出对铁死亡和纤维化脆弱性增高的细胞状态。
3.9. QUE预防赋予原代人气道上皮细胞对BLM诱导的铁死亡、衰老和纤维化表型的抗性
在HAECs中验证了QUE的预防效应。与在MLE-12细胞中的观察相似，QUE预处理在HAECs中诱导了ROS的轻度升高，并伴有GSH水平升高。在随后的BLM攻击中，QUE预处理的HAECs表现出显著改善的细胞活力、LDH释放、脂质ROS水平、GSH/GSSG比值和GPx4表达，同时纤维化表型变化得到缓解。
4. 讨论
本研究采用明确的预防方案（在BLM攻击前给QUE），证明QUE预防能有效限制肺泡上皮细胞丢失、铁死亡和衰老水平的峰值，同时达到与常规QUE治疗相当的抗纤维化效果。转录组和分子分析进一步揭示，与QUE治疗相比，QUE预防能更优异地保存在BLM攻击后存活的肺泡上皮细胞中的GPx4表达和GSH代谢。这表明细胞在应对进一步损伤时保留了抗氧化应激的能力。机制上，本研究排除了预防效应源于损伤峰值期药物残留或主要源于清除衰老细胞的可能性。相反，转录组分析和分子分析揭示，QUE在健康肺泡上皮细胞中诱导了ROS的轻度升高，这是一种与其在衰老细胞中ROS清除作用相反的促氧化效应。这种有限的应激可能源于QUE对抗凋亡通路的干扰。它没有损害细胞核心特性，而是触发了持续的反应，上调了GSH代谢和GPx4表达。我们认为这种持续反应是增强铁死亡和纤维化抗性的基础。QUE诱导的ROS与保护之间的因果关系得到证实，因为用Mito-TEMPO或Z-VAD-FMK共处理可逆转QUE诱导的ROS、GSH和GPx4增加，并同时消除对BLM的抗性。这种ROS依赖的预适应机制可能不仅限于QUE，因为精细滴定过的H2O2预处理也能对BLM提供部分保护。研究进一步确定14-3-3γ是QUE预防的关键介质。QUE诱导14-3-3γ上调，进而促进NRF2磷酸化和核转位，从而增强GSH合成和GPx4表达。至关重要的是，QUE对BLM诱导的铁死亡、衰老和纤维化发生的预防效应在14-3-3γ沉默的肺泡上皮细胞中被消除。最后，在原代HAECs中，QUE也一致地提高了轻度ROS和GSH，并赋予了对BLM诱导的铁死亡和促纤维化表型转变的预防。
5. 结论
本研究结果证明了QUE在肺纤维化小鼠模型中的预防功效，并阐明了其在健康肺泡上皮细胞中被低估的促氧化作用，这是其预防作用的核心。这些发现拓展了QUE的药理功能，使其成为一种“抗氧化疫苗”：它启动了适应性氧化应激反应，在肺泡上皮细胞中诱导出一种铁死亡抗性状态，从而减轻纤维化发生的易感性。
