本文旨在探讨整合应激反应相关基因在肺动脉高压（PAH）诊断中的作用，通过整合转录组学、单细胞测序和实验验证，鉴定出四个潜在的诊断生物标志物：ABCC4、ATM、SERPINH1和ZBTB40，揭示了其在免疫浸润和细胞重塑中的关键作用，为PAH的病理机制研究和靶向治疗提供了新的视角和工具。

《Clinical and Experimental Hypertension》：Bulk and single-cell transcriptomics for identification of potential diagnostic biomarkers associated with pulmonary arterial hypertension and integrated stress response and experimental validation

肺动脉高压（PAH）是一种致命的血管疾病，其特征是肺血管不可逆重塑。本研究旨在通过整合生物信息学、单细胞转录组学和实验方法，鉴定并验证与整合应激反应（ISR）相关的PAH潜在诊断生物标志物。研究发现四个ISR相关基因（ABCC4、ATM、SERPINH1和ZBTB40）是诊断PAH的新生物标志物，并在临床样本中得到验证。该研究为理解PAH的发病机制及开发新的诊断和治疗策略提供了新见解。（编辑推荐）

　　

整合应激反应（ISR）作为真核细胞中应对多种应激因素的核心通路，在维持细胞内稳态中扮演着关键角色。近年来，其与肺动脉高压（PAH）等心血管疾病发病机制的关联逐渐受到关注。本研究系统性地探索了ISR相关基因（ISR-RGs）在PAH中的作用，旨在鉴定其作为疾病诊断生物标志物的潜力，并深入解析其参与的分子与细胞机制。

筛选与富集分析候选基因

研究首先通过分析肺动脉高压（PAH）患者与健康对照的批量RNA测序（RNA-seq）数据集（GSE38267， GSE131793），识别出1697个差异表达基因（DEGs）。通过与已知的529个ISR相关基因取交集，最终确定了46个候选基因。对这些候选基因进行功能富集分析显示，它们显著富集于对缺氧的细胞反应、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性以及细胞凋亡、内质网中的蛋白质加工等通路，暗示ISR通路可能通过调控这些生物学过程参与PAH的病理进程。

通过机器学习筛选潜在诊断生物标志物

为精准识别与PAH发病机制最相关的基因，研究者应用了机器学习算法对候选基因进行进一步筛选。通过LASSO（最小绝对收缩和选择算子）回归分析，筛选出5个关键基因（SERPINH1， ZBTB40， ATM， GSTM4， ABCC4）。同时，利用Boruta算法进行特征选择，得到了21个重要基因。将两者的结果取交集，最终得到5个特征基因。通过在训练集和验证集中比较这些基因的表达水平，发现有4个基因在PAH组与对照组之间呈现显著且一致的表达差异：ABCC4在PAH中表达上调，而ATM、SERPINH1和ZBTB40则表达下调。因此，这4个基因被确定为与PAH密切相关的潜在诊断生物标志物。

预测模型的构建与生物标志物特性分析

基于这4个生物标志物的表达水平，研究者构建了一个用于预测PAH风险的列线图（Nomogram）模型。校准曲线显示该模型拟合良好，霍斯默-莱梅肖检验P值为0.432，表明其具有可靠的预测性能。随后，对生物标志物进行了特性分析。染色体定位显示ZBTB40位于1号染色体，ABCC4位于13号染色体，ATM和SERPINH1均位于11号染色体且位置相近。亚细胞定位预测表明，ABCC4、ATM和ZBTB40编码的蛋白在细胞核中占比较高，而SERPINH1编码的蛋白则在细胞质中富集。功能相似性预测提示ZBTB40与其他基因功能相似性较高。

基因集富集分析揭示生物学功能

为了深入探究这些生物标志物可能参与的生物学过程和信号通路，研究进行了基因集富集分析（GSEA）。结果显示，ABCC4主要富集于中性粒细胞脱颗粒、糖皮质激素受体通路等；ATM和ZBTB40均富集于翻译起始、核糖体、真核翻译延伸等与蛋白质合成密切相关的通路；SERPINH1则富集于嗅觉转导、角化等通路。综合来看，这些生物标志物广泛参与了翻译控制和中性粒细胞介导的炎症过程，这两者在PAH的血管重塑和免疫失调中均扮演重要角色。

免疫细胞浸润特征及其关联

研究进一步通过ssGSEA算法分析了PAH发展过程中的免疫微环境特征。结果发现，PAH组与对照组之间有16种免疫细胞的组成存在显著差异。例如，PAH组中活化的CD8⁺T细胞显著减少，而活化的树突状细胞、中枢记忆CD8⁺T细胞等则显著增加。相关性分析表明，ABCC4与大多数差异免疫细胞呈显著正相关，例如与自然杀伤（NK）细胞正相关。相反，ATM、SERPINH1和ZBTB40则与大多数差异免疫细胞呈显著负相关，例如与活化的树突状细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等负相关。

调控网络构建与潜在治疗药物预测

为了探索生物标志物的上游调控机制，研究构建了长链非编码RNA（lncRNA）-微小RNA（miRNA）-信使RNA（mRNA）调控网络，揭示了如AL137782.1-hsa-miR-125b-5p-ABCC4、NORAD-hsa-miR-577-ZBTB40等潜在的调控关系。接着，通过药物-基因相互作用数据库预测了靶向这些生物标志物的潜在治疗药物，共获得9种药物。分子对接分析显示，药物CAMONSERTIB与ATM蛋白的结合最为稳定，结合能为-10.2 kcal/mol。进一步的分子动力学模拟也验证了该复合物在100 ns模拟时间内结构稳定。

CAMONSERTIB的体内外治疗潜力验证

研究者进一步在动物和细胞模型上验证了CAMONSERTIB对PAH的治疗潜力。在低氧诱导的肺动脉高压小鼠模型中，CAMONSERTIB治疗能显著降低右心室收缩压，并增加肺动脉加速时间。肺组织免疫荧光染色显示，CAMONSERTIB减轻了低氧引起的肺动脉肌化程度。在细胞实验中，CAMONSERTIB处理降低了低氧诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖标志物PCNA的阳性率，并显著抑制了细胞的迁移能力。这些结果初步证实了CAMONSERTIB在体内外对肺动脉高压具有治疗作用。

单细胞转录组测序揭示关键细胞类型

为了在单细胞分辨率下解析PAH的细胞机制，研究对肺动脉组织的单细胞RNA测序数据集进行了分析。经过质量控制、标准化、降维和聚类后，细胞被注释为10种类型：成纤维细胞、T细胞、巨噬细胞、单核细胞、平滑肌细胞、NK细胞、内皮细胞、上皮细胞、肥大细胞和B细胞。通过比较PAH与对照样本中各类细胞的比例，发现T细胞和肥大细胞的比例在PAH组中升高，而单核细胞的比例降低。进一步分析生物标志物在这些差异细胞中的表达，发现ABCC4在单核细胞中的表达在PAH组显著降低，而ATM和ZBTB40在T细胞中的表达显著升高。因此，单核细胞和T细胞被确定为与这些生物标志物相关的关键细胞。

细胞间通讯与T细胞伪时间轨迹分析

对10种细胞类型进行细胞间通讯分析发现，与对照组相比，PAH组中T细胞的通讯数量和强度均增加，而单核细胞的通讯则减少。配体-受体相互作用分析显示，T细胞与单核细胞之间的通讯涉及ANXA1-FPR1相互作用，而T细胞与内皮细胞之间的通讯在PAH组显著增强，涉及CCL5-ACKR1相互作用。此外，对关键细胞T细胞进行伪时间轨迹分析，将其分为4个亚群，并揭示了其分化轨迹。生物标志物表达模式分析显示，ABCC4和ZBTB40主要表达于分化早期，SERPINH1主要分布于晚期，而ATM在早晚期均有表达。

临床样本验证生物标志物

最后，研究通过收集25对PAH患者和健康对照者的全血临床样本，利用逆转录定量聚合酶链反应和酶联免疫吸附试验对生物信息学分析结果进行验证。实验结果证实，与对照组相比，PAH组中ABCC4的基因和蛋白表达水平均显著上调，而ATM、SERPINH1和ZBTB40的基因和蛋白表达水平均显著下调，这与生物信息学分析的结果完全一致，从而验证了所筛选生物标志物的可靠性。

讨论与展望

本研究首次系统性地将ISR通路与PAH的分子诊断联系起来，鉴定出ABCC4、ATM、SERPINH1和ZBTB40四个新型ISR相关诊断生物标志物。ABCC4编码的多药耐药相关蛋白4通过调节环核苷酸外排影响血管平滑肌细胞功能；ATM作为DNA损伤应答的关键传感器，其与ISR的关联为理解PAH提供了新视角；SERPINH1编码的热休克蛋白47与内质网应激和胶原代谢相关；而ZBTB40则可能通过调控核糖体相关基因参与ISR介导的生长重编程。所构建的列线图模型为PAH的无创分子分型和风险评估提供了潜在工具。单细胞分析揭示T细胞和单核细胞是核心细胞类型，其代谢活性和细胞间通讯的改变在疾病进程中至关重要。此外，发现的潜在治疗药物CAMONSERTIB在临床转化中具有重要价值。未来研究可围绕扩大样本验证、深入功能实验、探索药物重定位（如GLP-1类药物、20S蛋白酶体抑制剂、天然化合物hinokitiol等）以及阐明生物标志物在ISR通路中的具体作用机制等方面展开，从而为PAH的精准诊断和靶向治疗开辟新的道路。