AMPK依赖的心脏成纤维细胞外泌体诱导hiPSC-CM成熟的机制与治疗潜力

《Clinical and Experimental Hypertension》：AMPK-dependent maturation of hiPSC-derived cardiomyocytes induced by human cardiac fibroblast exosomes

本研究通过系统性的体外与体内实验，首次揭示人心脏成纤维细胞来源的外泌体（hc-FB-EXOs）能够通过激活AMPK信号通路，促进人诱导多能干细胞来源心肌细胞（hiPSC-CMs）在结构、代谢和电生理层面的全面成熟，并显著增强其在心肌梗死模型中的心脏修复疗效，为优化基于hiPSC-CMs的细胞治疗策略提供了新的、无细胞的辅助方案。

　　

背景

心肌梗死是全球心力衰竭和心血管死亡的主要原因，基于人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）的再生治疗是恢复受损心肌收缩功能的潜在策略。然而，hiPSC-CMs通常表现出胎儿样表型，包括细胞尺寸小、肌节结构紊乱、电生理不成熟以及代谢以糖酵解为主，这些不成熟特征限制了其治疗效能并可能增加移植后心律失常风险。因此，寻找促进hiPSC-CMs成熟的有效方法是该领域的关键挑战。心脏成纤维细胞（hc-FBs）是心脏中最丰富的非心肌细胞，通过旁分泌信号影响心肌细胞发育。外泌体作为细胞间通讯的重要媒介，其作用日益受到关注。本研究旨在探究人心脏成纤维细胞来源的外泌体（hc-FB-EXOs）是否能促进hiPSC-CMs的成熟，并提升其在心肌梗死后的治疗效益。

方法

研究人员从培养的人心脏成纤维细胞中分离出外泌体（hc-FB-EXOs），并使用透射电镜和Western blot对其进行了鉴定。将hiPSC-CMs分为实验组（EXO组，添加hc-FB-EXOs）和对照组（NC组，添加等体积DPBS溶液），从多个层面评估其成熟度。

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  细胞形态与结构：通过免疫荧光染色分析细胞面积、圆形度指数、肌节长度和双核化率。
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  分子标志物：利用Western blot和定量PCR检测肌球蛋白重链（MYH6、MYH7）、肌钙蛋白（cTnI、TNNI1、TNNI3）以及连接蛋白Titin亚型（N2B、N2BA）的表达变化。
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  代谢功能：使用Seahorse XF96细胞能量代谢分析仪测量细胞的氧消耗率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR），并检测线粒体功能相关基因（如ND1、LPL）的表达。
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  电生理特性：采用全细胞膜片钳技术记录钠离子通道电流（I_Na）、动作电位（包括振幅、最大上升速率V_max、APD₅₀和APD₉₀）；利用CardioExcyte 96系统记录细胞搏动频率（BR）和场电位持续时间（FPD_max）。
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  机制探索：通过RNA测序进行转录组学分析，并利用Western blot验证AMPK信号通路及相关脂肪酸代谢蛋白（如p-AMPK、CPT1、p-ACC1、SCD1）的表达。同时使用AMPK激活剂（AMPK activator 4）和抑制剂（dorsomorphin）进行功能验证。
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  体内疗效评估：建立小鼠心肌梗死模型，随机分为假手术组、MI组（仅注射PBS）、hiPSC-CMs组和hiPSC-CMs+EXO组（共同注射细胞与外泌体）。术后4周，通过超声心动图评估左心室射血分数（LVEF）和短轴缩短率（FS），通过天狼星红/固绿染色评估梗死面积，并通过人特异性心肌肌钙蛋白T（hcTnT）免疫染色评估移植物密度。

结果

1. 1.
   hc-FB-EXOs抑制hiPSC-CMs的细胞周期活性并促进成熟标志物表达
   透射电镜证实成功提取了典型双层膜结构的hc-FB-EXOs（直径约155 nm）。Western blot显示，与NC组相比，EXO组中细胞周期蛋白Cyclin D3表达显著降低，而p18和p-WEE1表达显著升高，表明hc-FB-EXOs处理促进了hiPSC-CMs退出细胞周期。同时，成熟心肌标志物MYH7和cTnI的蛋白表达上调，而胎儿型标志物MYH6表达下调。在mRNA水平，MYH7表达上调，Titin的成熟亚型N2B表达占主导，且成熟型肌钙蛋白TNNI3与胎儿型TNNI1的比值升高，进一步证实了hc-FB-EXOs对心肌细胞成熟的促进作用。
2. 2.
   hc-FB-EXOs改善hiPSC-CMs的形态结构
   免疫荧光分析显示，与NC组相比，EXO组hiPSC-CMs的细胞表面积和肌节长度显著增加，细胞圆形度指数显著降低，双核化率升高。这表明hc-FB-EXOs处理使hiPSC-CMs获得了更接近成年心肌细胞的伸长形态和更规整的肌节结构。
3. 3.
   hc-FB-EXOs诱导hiPSC-CMs代谢重编程
   EXO组hiPSC-CMs的线粒体功能相关基因ND1和LPL的mRNA表达显著升高。Seahorse代谢分析表明，EXO组细胞的基线耗氧率（OCR）、最大耗氧率、备用呼吸能力以及非线粒体耗氧率均显著高于NC组，同时细胞外酸化率（ECAR）也显著增加。这些结果共同表明，hc-FB-EXOs处理增强了hiPSC-CMs的线粒体氧化磷酸化能力和糖酵解活性，促使其代谢模式从胎儿期的糖酵解为主向成年期的脂肪酸氧化为主转变。
4. 4.
   hc-FB-EXOs促进hiPSC-CMs电生理成熟
   CardioExcyte 96记录显示，EXO组hiPSC-CMs的搏动频率显著低于NC组，而场电位持续时间（FPD_max）在培养第7天和第10天时显著延长。膜片钳实验进一步揭示，EXO组细胞的钠离子通道峰值电流密度（I_Na）绝对值、动作电位振幅和最大去极化速率（V_max）均显著增加，钠通道的半激活电压和半失活电压降低。尽管动作电位时程（APD₅₀和APD₉₀）有所缩短，但APD₉₀/APD₅₀的比值在EXO组更高，这些电生理特性的改变均指向更成熟的表型。
5. 5.
   hc-FB-EXOs通过激活AMPK信号通路发挥促成熟作用
   转录组测序分析发现，hc-FB-EXOs处理引起了hiPSC-CMs基因表达的广泛变化，差异表达基因富集在细胞周期、信号转导等通路，其中AMPK信号通路与心肌细胞成熟密切相关。Western blot验证显示，EXO组细胞中磷酸化AMPK（p-AMPK）和肉碱棕榈酰转移酶1（CPT1）表达上调，而硬脂酰-CoA去饱和酶1（SCD1）和磷酸化乙酰辅酶A羧化酶1（p-ACC1）表达下调。使用AMPK激活剂可模拟hc-FB-EXOs的效果，而AMPK抑制剂则可逆转这些变化，证实了AMPK通路在其中的核心作用。此外，miRNA测序及整合分析提示，hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-29b-3p和hsa-let-7g-5p等miRNA可能参与调控AMPK通路。
6. 6.
   hc-FB-EXOs增强hiPSC-CMs在心肌梗死模型中的治疗潜力
   体内实验结果表明，与仅移植hiPSC-CMs相比，联合注射hc-FB-EXOs和hiPSC-CMs能更显著地改善心肌梗死小鼠的心功能，表现为更高的左心室射血分数（LVEF）和短轴缩短率（FS）。组织学分析显示，联合治疗组小鼠的梗死面积更小，左心室前壁厚度更大，且移植物中的人源心肌细胞（hcTnT阳性）密度显著提高（约3倍）。这表明hc-FB-EXOs不仅促进了hiPSC-CMs的体外成熟，也增强了其在体内的存活、整合与修复能力。

讨论与结论

本研究系统阐明了人心脏成纤维细胞来源的外泌体（hc-FB-EXOs）作为一种有效的、无细胞的成熟诱导剂，能够全方位地促进hiPSC-CMs的结构、代谢和电生理成熟。其核心机制在于激活了AMPK信号通路，进而驱动了细胞代谢从糖酵解向脂肪酸氧化的重编程。这种成熟化处理最终转化为更优越的体内治疗效益，在心肌梗死模型中实现了更佳的心脏功能恢复和移植物存活。

与传统的基因工程或复杂三维培养平台相比，外泌体提供了一种简单、可扩展且无细胞的优化策略。未来研究需在更多hiPSC细胞系和大动物模型中进行验证，并深入解析外泌体中具体起作用的活性成分（如特定miRNA或蛋白质），评估其在高血压等病理背景下长期治疗的安全性与有效性。本研究为优化基于hiPSC-CMs的再生疗法，治疗缺血性心肌病等心脏疾病提供了新的思路和实验依据。