肿瘤内微小单胞菌通过p-甲酚诱导的Treg细胞分化促进食管鳞状细胞癌进展

《SCIENCE ADVANCES》：Intratumoral Parvimonas micra promotes esophageal squamous cell carcinoma via p-cresol–induced Treg differentiation

本文针对食管鳞状细胞癌（ESCC）中瘤内微生物组的作用机制尚不明确的问题，研究人员通过宏基因组测序、单细胞RNA测序及动物模型实验，揭示了口腔来源的厌氧菌Parvimonas micra（P. micra）在肿瘤组织中富集且与不良预后相关。该菌通过分泌代谢产物p-cresol（p-甲酚）提升CD4+T细胞中活性氧（ROS）水平，进而诱导FOXP3+Treg细胞分化，形成免疫抑制微环境并促进肿瘤生长。这一发现首次阐明了ESCC中瘤内微生物通过代谢物调控免疫微环境的具体通路，为靶向微生物-免疫互作的ESCC治疗策略提供了新思路。

　　

食管癌是全球癌症相关死亡的主要原因之一，其中食管鳞状细胞癌（Esophageal Squamous Cell Carcinoma, ESCC）占全球食管癌病例的约85%，半数发生在中国。尽管过去十年ESCC研究取得了显著进展，但诊断仍依赖于内镜检查，而程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）抑制剂等新型疗法的疗效有限。这些限制凸显了进一步研究以阐明ESCC潜在机制的迫切性。肿瘤微环境的复杂性，包括免疫细胞、基质细胞、细胞外基质和微生物，已成为理解ESCC发病机制的关键。近年来越来越多的证据强调微生物组与免疫微环境之间的新兴相互作用，微生物组通过物理相互作用、代谢产物产生和致癌毒素生成等过程促进癌症的发生和发展。然而，ESCC微生物组的研究仍相对不足，现有研究往往受限于小样本队列和对16S核糖体RNA（rRNA）测序的依赖，且机制研究主要集中在从其他癌症移植的两种病原体——Fusobacterium nucleatum和Porphyromonas gingivalis上。因此，系统探索与ESCC发病机制相关的更广泛微生物景观至关重要。

在这项研究中，研究人员利用多组学技术结合动物模型，深入探讨了ESCC瘤内微生物组的组成、功能及其与宿主免疫微环境的相互作用。论文发表于《SCIENCE ADVANCES》期刊。

为开展研究，作者主要运用了以下关键技术方法：对来自119名ESCC患者的配对肿瘤-正常组织进行宏基因组测序，并对45个样本进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）以分析微生物-宿主互作；通过荧光原位杂交（FISH）和定量聚合酶链反应（qPCR）验证关键微生物的富集；使用皮下肿瘤小鼠模型进行体内功能验证；通过流式细胞术、蛋白质印迹（Western blot）和代谢组学分析揭示微生物代谢产物的作用机制。样本队列主要来源于中国河南省林州市食管癌医院在2018年至2021年间接受手术切除的ESCC患者。

ESCC瘤内微生物组特征及其预后相关性

通过对119例ESCC患者的配对肿瘤和癌旁正常组织进行宏基因组测序，研究人员发现肿瘤组织与正常组织的微生物群落结构存在显著差异，样本类型（肿瘤 vs. 正常）是影响瘤内群落结构的最重要因素。肿瘤组织中细菌载量更高，且富集的物种多为厌氧或兼性厌氧菌。他们鉴定了87个在肿瘤组织中富集的物种和77个在正常组织中富集的物种。通过多变量Cox回归分析，确定了116个与ESCC总生存期（OS）显著相关的物种，其中101个被归类为不良预后微生物，15个为有利预后微生物。特别聚焦于肿瘤富集且与不良预后相关的微生物（TPPMs），Parvimonas micra（P. micra）被确定为最主要的TPPM之一。其在肿瘤组织中的富集通过qPCR和FISH得到证实，并且在独立的胃癌（GC）和结直肠癌（CRC）数据集分析中，P. micra在肿瘤组织中的丰度也显著更高，提示其在胃肠道癌症中的富集可能是一种普遍现象。此外，对泛癌免疫治疗队列数据的分析表明，对免疫检查点抑制剂（ICIs）无反应的患者比有反应的患者表现出更高的P. micra丰度。

P. micra塑造免疫抑制性肿瘤微环境

利用单细胞RNA测序数据，研究人员分析了ESCC肿瘤微环境的细胞组成和功能。他们发现ESCC肿瘤中富含CD4⁺调节性T细胞（T_reg）和肌成纤维样癌症相关成纤维细胞（myCAFs），而CD8⁺组织驻留记忆T细胞（CD8_Trm）和CD4⁺组织驻留记忆T细胞（CD4_Trm）则减少。生存分析显示，肿瘤组织中CD4⁺T_reg细胞比例较高与较短的总生存期相关。进一步分析发现，P. micra的丰度与CD4⁺T_reg细胞和CD4⁺增殖性T细胞的浸润呈正相关。多重免疫荧光（mIF）染色证实，与癌旁正常组织相比，肿瘤中T_reg细胞浸润增加，并且P. micra水平与肿瘤和癌旁正常组织中的T_reg细胞浸润均相关。

P. micra通过体内诱导FOXP3⁺T_reg细胞驱动肿瘤生长

为了验证P. micra的促癌作用，研究人员使用了皮下肿瘤小鼠模型。瘤内注射P. micra显著促进了肿瘤生长，并通过FISH分析证实了其在肿瘤内的定植。mIF染色显示，与磷酸盐缓冲盐水（PBS）对照组相比，P. micra处理组肿瘤组织中的T_reg细胞浸润显著增加。同时，在P. micra处理组的肿瘤组织中，细胞毒性GZMB⁺CD8⁺T细胞的比例显著下降，而耗竭性PD-1⁺CD8⁺T细胞的比例相应增加。这些发现表明，P. micra可能通过促进T_reg细胞浸润到肿瘤微环境来促进ESCC进展，进而抑制抗肿瘤免疫反应。

P. micra通过代谢产物创造免疫抑制微环境促进肿瘤生长

为了探究P. micra是否通过其分泌物质影响T细胞功能，研究人员用P. micra条件培养基（P. micraCM）或热灭活的P. micra处理人T淋巴细胞白血病细胞系Jurkat和小鼠脾脏CD4⁺T细胞。结果显示，P. micraCM以剂量依赖性方式上调了FOXP3、TGFB1和IL10的mRNA水平以及FOXP3、TGF-β1和IL-10的蛋白水平，并增加了FOXP3⁺CD25⁺T_reg细胞的比例，而热灭活的P. micra则没有显著影响。热灭活的P. micraCM与未灭活的P. micraCM效果相似，表明P. micra产生的小分子代谢物而非分泌蛋白，对通过增强T_reg细胞活性相关关键调节因子和效应分子的表达来调节T细胞功能至关重要。体内实验也证实，瘤内注射P. micraCM能显著促进肿瘤生长，并增加T_reg细胞浸润，同时降低CD8⁺T细胞的细胞毒功能并增加其耗竭标记物表达。体外细胞增殖实验表明，P. micraCM并未显著改变正常食管上皮细胞或ESCC细胞的增殖。这些发现共同表明，P. micra通过其代谢物诱导FOXP3⁺T_reg分化来促进肿瘤生长，而非直接刺激ESCC细胞增殖。

p-Cresol驱动T_reg分化和肿瘤进展

为了鉴定P. micra中介导肿瘤进展的微生物代谢物，研究人员对皮下肿瘤模型的肿瘤间质液进行了非靶向代谢组学分析。与PBS组相比，注射P. micra的肿瘤表现出不同的代谢组学特征，在细菌衍生的代谢物中，p-cresol（p-甲酚）的变化最为显著。其初级衍生物p-cresol sulfate（PCS）是所有代谢物中差异最显著的，另一个衍生物p-cresol glucuronide也表现出明显差异。对P. micra参考基因组的同源性分析发现，其序列与酪氨酸转化为p-cresol途径中的关键酶（如FldBC复合物、HpdA和AcdA）具有显著相似性，提示P. micra具有产生p-cresol的遗传潜力。质谱分析证实，与对照培养基相比，P. micra培养物中p-cresol水平显著升高。先前研究表明，p-cresol及其衍生物PCS可通过产生活性氧（ROS）在各种细胞类型中诱导氧化应激。而T_reg细胞依赖于氧化磷酸化衍生的ROS来稳定FOXP3表达并维持免疫抑制稳定性。因此，研究人员假设p-cresol和PCS诱导的ROS可能调节T_reg分化和功能。实验证实，p-cresol处理以剂量依赖性方式上调FOXP3、IL-10和TGF-β1的蛋白水平，并增强ROS水平，而这种效应可被ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）抑制。此外，蛋白质印迹分析、qPCR和流式细胞术结果均表明，NAC能够消除p-cresol驱动的T_reg分化和功能。单细胞RNA测序数据分析显示，T_reg细胞具有最高的ROS特征评分，且CD4⁺T细胞的ROS特征评分与组织中P. micra的相对丰度呈正相关，支持了P. micra提升CD4⁺T细胞ROS水平的假设。体内实验进一步证明，在皮下肿瘤小鼠模型中瘤内注射p-cresol可显著促进肿瘤生长，增加T_reg细胞浸润，同时降低CD8⁺T细胞的细胞毒性并增强其耗竭，而所有这些p-cresol诱导的效应均可通过施用NAC来消除。

研究结论与讨论

本研究证明了食管肿瘤微生物组与癌旁正常组织存在显著差异，并确定了P. micra是一种通过代谢物介导的免疫抑制促进ESCC进展的关键细菌。首先，研究发现肿瘤组织富含厌氧菌，这表明缺氧的肿瘤微环境可能选择性地支持它们的生长。值得注意的是，在肿瘤中富集并与较差临床结果相关的微生物（即TPPMs）主要由与牙周病、龋齿和牙髓感染相关的口腔微生物组成。这进一步得到临床观察的支持，即口腔卫生不良与ESCC风险增加相关。口腔微生物易位正日益被视为跨疾病的致病机制。本研究通过多方面的分析和实验验证，揭示了P. micra在ESCC肿瘤进展中的关键作用。P. micra是一种营养要求苛刻、革兰氏阳性、专性厌氧菌，主要定植于口腔黏膜表面。其富集已在口腔鳞状细胞癌、胃癌和结直肠癌中被记录。然而，其在肿瘤进展中的机制作用在很大程度上仍未探索，仅在结直肠癌中有少量研究。与这些研究不同，本研究发现P. micra并未显著影响正常食管上皮细胞或ESCC细胞的增殖。相反，我们证明P. micra通过促进免疫抑制显著塑造了肿瘤微环境。具体来说，P. micra定植导致肿瘤微环境中T_reg细胞浸润增加。这种差异突出了宿主-微生物组相互作用的组织特异性，并表明P. micra可能根据局部免疫和代谢环境采取不同的致癌机制。代谢物通过免疫调节在肿瘤发生中发挥着复杂而关键的作用。与这些已确立的机制相反，对ESCC的代谢组学分析未发现短链脂肪酸或色氨酸代谢物水平有显著变化，而是发现了p-cresol及其衍生物的富集。本研究证明了其在T_reg分化和肿瘤进展中的作用。具体来说，p-cresol提高了CD4⁺T细胞中的ROS水平，促进FOXP3⁺T_reg分化，并创造一个免疫抑制微环境从而促进肿瘤生长。这项工作确定了p-cresol是一种关键的微生物代谢物，它将微生物群失调与肿瘤免疫耐受联系起来，增进了我们对微生物衍生代谢物如何影响肿瘤微环境的理解。值得注意的是，对泛癌免疫治疗队列的分析表明，P. micra富集与免疫治疗反应性降低之间存在潜在关联。我们的研究结果表明，将免疫疗法（如PD-1抑制剂）与抗氧化剂（如NAC）联合使用，可能是治疗P. micra富集型ESCC的一种有前景的策略。然而，仍有一些问题尚未解决。尽管我们聚焦于P. micra作为一个关键物种，但它并非肿瘤中富集或与不良预后相关的唯一微生物。其在更广泛的黏膜多微生物群落中的协同相互作用对肿瘤发展的影响也尚未探索。在机制上，虽然我们确定了p-cresol分泌及其与T_reg细胞的相互作用是关键，但其他代谢物以及与不同免疫或基质细胞的相互作用也可能在ESCC进展中发挥作用。此外，我们的研究仅关注ESCC和正常组织，缺乏癌前病变样本，这需要进一步研究来阐明微生物组在ESCC发展不同阶段的作用。新兴研究表明，瘤内微生物的分布并非随机，而是表现出不同的空间偏好。因此，迫切需要通过空间组学数据来绘制这些群落的结构图并解读它们与肿瘤微环境之间错综复杂的相互作用。总之，本研究揭示了P. micra通过微生物代谢物介导的免疫调节这一关键机制驱动ESCC进展。这凸显了肿瘤相关微生物，特别是口腔致病菌，通过多种机制在肿瘤发生中的关键作用，值得进一步研究。此外，应探索它们在肿瘤风险评估和治疗干预中的转化潜力。