Bag1介导的26S蛋白酶体构象重塑揭示泛素非依赖性底物直接转运的新机制

《SCIENCE ADVANCES》：Structures of the 26S proteasome in complex with the Hsp70 co-chaperone Bag1 reveal a mechanism for direct substrate transfer

本研究揭示了Hsp70共伴侣蛋白Bag1通过与蛋白酶体亚基Rpn1结合，诱导26S蛋白酶体发生前所未有的构象重排，包括AAA+ATPase环的显著变形及20S核心颗粒入口门的开放。这种重塑形成了一个位于20S入口上方的大型空腔，使得Rpt2和Rpt5的pore-2环能够直接撬开20S门，从而在无需底物泛素化修饰的情况下，实现由Hsp70结合的未折叠蛋白直接向蛋白酶体降解腔室的转运。该发现阐明了一种全新的泛素非依赖性蛋白酶体降解机制，对理解细胞在应激条件下清除错误折叠蛋白、维持蛋白质稳态具有重要意义。

　　

在细胞的微观世界里，维持蛋白质的质量控制（Proteostasis）是一项生死攸关的任务。细胞持续产生新的蛋白质，同时也必须及时清除错误折叠、受损或不再需要的蛋白质，以防止它们积聚成有毒的聚集体，引发诸如阿尔茨海默病、帕金森病等神经退行性疾病。承担这一“清洁工”重任的核心机器之一是26S蛋白酶体，它如同一个精密的“蛋白质粉碎机”，能够识别、展开并将标记有泛素（Ubiquitin， Ub）链的靶蛋白降解为短肽。

然而，这套经典的泛素-蛋白酶体系统（Ubiquitin-Proteasome System， UPS）路径并非唯一选择。研究表明，许多未折叠蛋白、 intrinsically disordered proteins （IDPs， 内在无序蛋白）以及某些需要快速周转的调控蛋白，可以通过泛素非依赖性（Ub-independent）的途径被蛋白酶体降解。尤其是在细胞应激状态下，错误折叠蛋白大量产生，需要一种更直接、快速的清除机制。分子伴侣系统，特别是Hsp70家族，负责识别并试图复性这些错误折叠的蛋白。当复性失败时，如何将这些“客户”蛋白高效递送至蛋白酶体进行降解，是连接分子伴侣系统与降解系统的关键环节。共伴侣蛋白Bcl-2–associated anthanogene 1 （Bag1）被认为是连接Hsp70与26S蛋白酶体的桥梁，但其具体的结构机制和如何实现底物转运一直是个谜。本研究旨在破解Bag1如何介导Hsp70客户蛋白被26S蛋白酶体降解的分子机理。

为了阐明Bag1的作用机制，研究人员综合运用了多种生物物理与结构生物学技术。首先，通过size exclusion chromatography （SEC， 尺寸排阻色谱）和isothermal titration calorimetry （ITC， 等温滴定量热法）确定了Bag1通过其UBL结构域与蛋白酶体调节颗粒（Regulatory Particle， RP）的Rpn1亚基特异性结合，并能与Hsp70和Rpn1形成三元复合物。研究的关键在于利用冷冻电子显微镜（cryo–electron microscopy， cryo-EM）解析了Bag1结合的26S蛋白酶体的高分辨率结构，揭示了前所未有的构象状态。此外，还采用了cross-linking mass spectrometry （XL-MS， 交联质谱）分析来验证复合物中各组分间的空间邻近关系。在功能验证方面，通过ATP酶活性检测和以α-突触核蛋白（α-synuclein， α-syn）为模型底物的降解实验，评估了Bag1对蛋白酶体功能的影响。研究所用的蛋白酶体主要从人细胞（HEK 293T或Expi293F）中纯化获得。

研究结果

1. Hsp70共伴侣蛋白Bag1与蛋白酶体亚基Rpn1相互作用

SEC和ITC实验证实，Bag1通过其UBL结构域与26S蛋白酶体19S调节颗粒中的Rpn1亚基直接结合，结合位点是Rpn1 toroid domain上的T2接口。Bag1对Hsp70的核苷酸结合域（Hsp70_NBD）具有更高亲和力，并能同时结合Hsp70和Rpn1，形成Hsp70-Bag1-Rpn1三元复合物，且该复合物仍能结合模型底物RCMLA。cryo-EM解析的Hsp70_NBD:Bag1:Rpn1三元复合物低分辨率结构显示，Bag1的BD和UBL结构域将Rpn1_TD夹在中间。

2. Bag1结合的26S蛋白酶体的冷冻电镜结构

对Bag1结合的26S蛋白酶体进行cryo-EM分析，发现了与对照组截然不同的复杂构象景观。主要鉴定出三种构象状态：S_A（主要底物结合态）、S_BAG1和S_BAG2。其中S_BAG1状态（进一步分为S_BAG1.1、S_BAG1.2和S_BAG1.3）表现出最显著的ATP酶环变形，并观察到Bag1_UBL结合在Rpn1的T2位点。S_BAG2状态颗粒占比近一半，ATP酶变形程度较轻，但Rpn1表现出广泛的动态性。所有S_BAG结构均代表了此前未知的蛋白酶体构象。

3. Bag1结合诱导AAA⁺ATPase发生动态构象转变

S_BAG结构与已知的蛋白酶体结构（如代表门开放构象的S_D4状态）相比存在显著差异。Bag1结合导致Rpn1位置移动，并触发Rpt2 N末端从与Rpn1_TD相互作用转向其自身的OB-ATPase结构域界面，从而驱动ATP酶环发生剧烈变形。AAA⁺ATPase环失去了经典的螺旋楼梯构象，呈现出不对称的六聚体形状，亚基间紧密堆积的界面被打开，在环中心形成了一个巨大的空腔。这种变形导致ATP酶活性降低，并且关键的Arg-finger基序远离相邻亚基的核苷酸结合口袋，表明其ATP酶马达功能可能被抑制。

4. Bag1诱导的蛋白酶体门开放机制

令人意外的是，S_BAG1.1-1.3结构显示20S核心颗粒（Core Particle， CP）的门处于开放状态。与典型门开放机制不同，在这些结构中，仅观察到Rpt2、Rpt3和Rpt6的C末端尾部插入CP的α口袋。而Rpt1和Rpt5的C末端未被观察到。相反，Rpt2和Rpt5的保守pore-2环向CP门方向显著下移，分别与α4/α5和α6/α7的N末端相互作用，直接支撑并撬开了20S门。这表明在Bag1存在下，pore-2环承担了辅助门开放的新功能。

5. Bag1诱导的蛋白酶体降解机制模型

ATP酶环的变形和亚基位置的降低，在OB环与ATP酶环之间产生了一个约20 ?的缺口。这个缺口与ATP酶环中心的大型空腔相连，并一直延伸到开放的CP门，形成了一个潜在的“底物滑道”。通过将Hsp70_NBD:Bag1:Rpn1三元复合物模型对接到26S:Bag1结构中，并结合XL-MS数据，可以推测Hsp70的底物结合域（Hsp70_SBD）可能位于由Rpt4和Rpt5形成的OB-ATPase缺口附近。这种空间布局为未折叠蛋白从Hsp70直接“投放”到蛋白酶体降解腔室提供了理想路径。

6. Bag1增强泛素非依赖性底物降解

功能实验表明，Bag1能增强蛋白酶体对IDP模型底物α-syn的降解。当与Hsp70共同存在时，Bag1调节了降解速率。而单独的20S CP在Hsp70和Bag1存在下无法降解α-syn，证明该降解过程需要完整的26S蛋白酶体及其Bag1诱导的构象重排。这支持了Bag1通过促进蛋白酶体构象改变，以泛素非依赖性方式增强未折叠蛋白降解的新机制。

研究结论与讨论

本研究首次揭示了Bag1结合的26S蛋白酶体的高分辨率结构，阐明了一种全新的泛素非依赖性蛋白降解机制。Bag1不仅作为物理桥梁将Hsp70客户蛋白招募至蛋白酶体，其结合更引发了蛋白酶体调节颗粒前所未有的构象重排。这种重排的核心是AAA⁺ATPase环的剧烈变形，导致其失去典型的螺旋楼梯结构和 processive threading（进行性穿线）能力，但同时创造了一个从OB-ATPase界面缺口直达开放CP门的大型中央腔室。关键的发现是，Rpt2和Rpt5的pore-2环功能发生转换，从参与底物转移变为直接撬开20S门，与部分Rpt C末端尾部协同作用，实现门开放。

这些结构发现与功能数据共同描绘出一个模型：在Bag1介导下，Hsp70所携带的未折叠客户蛋白，可以被直接定位到变形蛋白酶体所形成的“底物滑道”入口，无需泛素化标记，也可能不依赖ATP酶的马达活性，即可进入CP腔室被降解。这为细胞在应激条件下快速清除大量错误折叠蛋白、防止蛋白质聚集提供了一条高效、直接的备用途径。该机制特别适用于降解易于聚集的IDPs（如α-syn），对于理解神经退行性疾病中蛋白质稳态失衡具有重要意义。此外，Bag1与另一种Hsp70共伴侣蛋白CHIP（一种E3泛素连接酶）的协同或竞争关系，以及该途径与去泛素化酶（DUBs）的潜在关联，将是未来研究的重要方向。这项工作不仅深化了对蛋白酶体机械功能多样性的理解，也为靶向蛋白质降解路径、干预相关疾病开辟了新的思路。